Определение содержания нуклеиновых кислот

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) в количестве до 1 % входит в состав всех живых клеток и обеспечивает передачу наследственности (генетический код), осуществляя синтез клеточных белков. ДНК обладает структурой двухцепочечного биополимера, состоящего из связанных нуклеотидов и имеет молекулярную массу около 1 млн. Да (табл. 8.14). Считается, что в составе некоторых клеток, например прокариот, вся наследственная информация хранится в одной большой молекуле ДНК с молекулярной массой порядка 2-10⁹. В микробных и животных клетках может содержаться несколько больших молекул ДНК. Кольцевые ДНК клеток, называемые плазмидами, используются в качестве «векторов» — трансформируемых биохимических веществ, применяемых в генной инженерии.

Таблица 8.14

Строение нуклеотидов ДНК и РНК

Русское наименование	Английское наименование	Символ		Структурная формула	ММ	Растворимость, г/100г
		РУС.	англ.			В воде при 20 °С	В воде при 100 °С	В этаноле при 20 °С
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Аденин	Adenine	А	А		131,5	0,09	2,5	МР
Гуанин	Guanine	Г	G		151,1	0,004	3	HP
Тимин	Thymine	т	Т		126,1	0,4	Р	МР

Русское наименование	Английское наименование	Символ		Структурная формула	ММ	Растворимость, г/100г
		РУС.	англ.			В воде при 20 °С	В воде при 100 °С	В этаноле при 20 °С
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Урацил	Uracil	У	и		121, 1	0,36	Р	МР
Цитозин	Cytosine	ц	С		111,1	0,77	Р	МР

Комбинация трех нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты называется кодоном. В соответствии с расшифрованным генетическим кодом такой кодон определяет в живой клетке синтез конкретной аминокислоты. Например UUG (—УУГ—) кодирует образование аминокислоты Leu (табл. 8.15).

Таблица 8.15

Генетический код

Увеличение содержания нуклеиновых компонентов более 1,5—2% в объектах пищевого назначения, считается небезопасным, поэтому, например, микробный белок, содержащий до 6—8% нуклеиновых компонентов, подвергают до использования в составе животных кормов денуклеинизации.

ВЫДЕЛЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ДНК МЕТОДОМ ЩЕЛОЧНОГО ЛИЗИСА

Все методы, связанные с выделением и количественным определением компонентов ДНК и РНК связаны, как правило, с разрушением определяемых объектов. Достижения генетической инженерии сегодня, позволяют выделять из клеток микроорганизмов без структурного азрушения плазмиды, представляющие собой кольцевые двухцепочечные ДНК. Они содержат около 4000 пар нуклеотдных фрагментов. С ними проводятосновные генетические манипуляции.

ОБОРУДОВАНИЕ

Аналитические весы. Конические колбы с пробками на 50 мл. Центрифуга на 8000 О. Термометры 0—100 °С. Ультратермостат 0—100 °С. Холодильник со льдом. Размельчитель тканей или микрогомогенизатор.

РЕАКТИВЫ

• 1. Лизирующий раствор 1: 25 мМ Трис-НС1, pH 8/50 мМ глюкозы / 20 мМ ЭДТА / 2 мг/мл лизоцима. Готовят растворением 3 г трис(гидроксиметил)аминометанаМН₂С(СН₂ОН)₃,9 г глюкозы и 7,45 г этилендиаминтетраацетата динатриевой соли С₁₀Н₁₄К₂Ка₂О₈-2Н₂0 (ЭДТА) в 0,5 л воды, устанавливают pH раствора равным 8, добавляя концентрированный раствор НС1, растворяют 2 г лизоцима и доводят общий объем раствора до 1 л. Срок хранения в холодильнике не более 7 суток.
• 2. Лизирующий раствор 2. Растворяют 1 г натрия додецилсульфата СН₃(СН₂)_иО8О₃Ка (808) в 99 мл 0,2 М (8 г/л) раствора ИаОН.
• 3. 3 М раствор натрия ацетата. Растворяют 408 г/л ацетата натрия СН₃СООКа-ЗН₂О в дистиллированной воде и устанавливают pH раствора 4,5—5,0, добавлением ледяной СН₃СООН.
• 4. Этанол 96%-й.
• 5. Трис-ацетатный буфер. 0,04 М Трис-ацетат/ 0,002 М ЭДТАpH 8,0. Готовят растворением 242 г/л Триса, 57,1 мл/л ледяной СН₃СООН до pH 8.
• 6. 5 М (246 г/л) раствор хлорида лития ЫС1, содержащий 0,75 г/л ЭДТА.

ХОД РАБОТЫ

• 1. Получают суспензию животной ткани клеток, гомогенизируя 1 г мяса с 15 мл воды, центрифугируют при5000 об/мин, надосадочную жидкость отбрасывают.
• 2. К осадку добавляют 1 мл лизирующего раствора 1, перемешивают, сразу добавляют 2 мл раствора 2. Смесь центрифугируют, надосадочную жидкость отделяют.
• 3. К полученной жидкости добавляют 1,5 мл 3 М раствора натрия ацетата, перемешивают до формирования осадка, который отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают.
• 4. К осадку добавляют 1 мл этанола, перемешивают в течение 10 мин, повторно центрифугируют. Надосадочную жидкость отбрасывают.
• 5. Осадок растворяют в 2 мл Трис-ацетатного буфера.
• 6. К раствору добавляют 2 мл 5 М раствора хлорида лития, перемешивают и выдерживают при температуре льда в течение 15 мин. Осадок отделяют центрифугированием.
• 7. П.п. 4—6 повторяют, к осадку ДНК добавляют 2 мл Трис-ацетатного буфера и используют для количественного определения содержания ДНК в растворе.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНК, РНК И ИХ КОМПОНЕНТОВ В ГИДРОЛИЗАТАХ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ПО

СПИРИНУ

Метод основан на способности ДНК, РНК и продуктов их расщепления (нуклеотидов) поглощать в ультрафиолетовой части спектра при 200—300 нм.

При кислотном гидролизе ДНК и РНК отщепляются фосфаты. Неорганическое содержание фосфора можно рассчитать по разнице поглощения при 270 и 290 нм.

ОБОРУДОВАНИЕ

Спектрофотометр с кюветами, пробирки.

РЕАКТИВЫ

Раствор ДНК. Раствор, содержащий 1 мг чистой ДНК в 1 мл, характеризуется поглощением О260 = 20,0.

ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЯ

В соответствии с инструкцией по эксплуатации подготавливают к работе спектрофотометр. В кювету заливают раствор экстрагированной ДНК и проводят измерение поглощения раствора при 270 и 290 нм против контроля, в качестве которого (2-я кювета сравнения) используют смесь 2 мл 5 М раствора хлорида лития и 2 мл Трис-ацетатного буфера.

РАСЧЕТ

Содержание нуклеинового фосфора (С, мг/мл) ДНК рассчитывают по формуле:

С, мг/мл = (О₂₇₀ — О_2ЭД) /0,19, где О₂₇₍₎ и В₂₉о — поглощение раствора при 270 и 290 нм.

Для того, чтобы перейти от количества фосфора к количеству ДНК, полученное значение содержания фосфора С умножают на 10,1. Для расчета содержания РНК значение С умножают на 10,5, поскольку содержание фосфатов в РНК в среднем составляет 9,5%, а в ДНК — 9,9%.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных определений. Точность определения в параллельных опытах ±20%, воспроизводимость в независимых определениях ±50%.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ К ГЛАВЕ 8

• 1. Какие сложности возникают при анализе биологически активных веществ природного происхождения?
• 2. Почему важно знать содержания аминокислот, углеводов и жирных кислот в природных объектах?
• 3. Какова точность определения содержания аминокислот, углеводов, ДНК и жирных кислот различными методами?
• 4. Как согласуется безопасный уровень содержания конкретного вещества и границы диапазона аналитического определения?
• 5. Каково влияние аппаратурного оснащения на точность выполнения аналитических процедур?

ЛИТЕРАТУРА К ГЛАВЕ 8

Овчинников, Ю. А. Биоорганическая химия. — М.: Просвещение, 1987.- 815 с.

Паронян, В. X. Технология и организация производства жиров и жирозаменителей. — М.: Де Ли принт, 2007. — 512 с.

Шмид, Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия. — М.: Бином. Лаборатория знаний, 2014. — 328 с.

Нестурх, М. Ф. Методы химии белков. — М.: Высшая школа, 2008. - 422 с.

Огнев, С. И. Аминокислоты, пептиды и белки. — М.: Высшая школа, 2005. — 365с.