Анализ аминокислот

В процессе переработки, прихранении и в составе живыхорганизмов, в том числе при переваривании, белки подвергаются гидролитическому распаду на составные части — аминокислоты. Основные аминокислоты, входящие в состав животных белков, являются Г-аминокислотами, но в природе аминокислоты проявляют оптическую активность и существуют в виде О, Г-рацематов (табл. 8.3). О-аминокислоты встречаются во многих антибиотиках пептидной природы.

Аминокислоты являются элементарными «химическими звеньями», из которых в живом организме «собираются» белковые цепи. Количественный анализ аминокислот характеризует качество всех белок содержащих продуктов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АЗОТА СВОБОДНЫХ АМИНОГРУПП В БЕЛКЕ (АМИННОГО АЗОТА)

При биохимических исследованиях возникает необходимость определять количество азота свободных аминогрупп, содержащихся в белках, пептидах или их гидролизатах. Такое определение может быть осуществлено методом формольного потенциометрического титрования (по Зеренсену — Гаврилову) продуктов гидролитического распада белков.

В процессе гидролиза белка при расщеплении пептидных (амидных) связей — ИН-СО— образуются свободные амино- и карбоксильные группы.

Метод формольного титрования основан на блокировании формальдегидом в нейтральной среде свободных аминогрупп с последующим титрованием карбоксильных групп щелочью. Количество свободных карбоксильных групп эквивалентно количеству свободных аминогрупп.

ОБОРУДОВАНИЕ

Лабораторный рН-метр с бюреткой вместимостью 50 мл. Химические стаканы и пипетки.

РЕАКТИВЫ

• 1. 37%-ный раствор формалина.
• 2. Гидроксид натрия хч, 0,2 М, 0,1 М, 0,05 М водные растворы ИаОН.
• 3. Растворы Н₂8О₄: 0,2 н., 0,1 н., 0,05 н.
• 4. Гидролизат белка или питательная среда.
• 5. 1 % раствор фенолфталеина.

Наиболее распространенные а-аминокислоты (D, L-рацематы)

Таблица 8.3

Циклические аминокислоты

	Proline	npo	Pro		115,1	6,10	16	23	1,5	222
	Oxy-proline	Onp	Opr		131,1	5,78	-	-	-	200

Окончание

Ароматические аминокислоты

+Фенил-аланин	Phenyl-alanine	Фен	Phe	C6H5CH2-CH(NH2) соон	165,2	5,88	3	10	-	284
+Трип-тофан	Trypto-phane	Три	Тгр		204,6	5,88	1	5	-	282
Тирозин	Tyro-zine	Тир	Туг	НОС6Н4СН2- CH(NH2) соон	181,2	5,65	0,05	0,5	-	344

Серосодержащие аминокислоты

Русское наименование +) — незаменимые амино-кислоты	Англ, наименование	Символ		Структурная формула	мм	Pl	Растворимость, г/100 г			Тразл.,°с
		РУС.	англ.				в воде при 20 °C	в воде при 100 °C	в этаноле при 20 °C
Глута-миновая кислота	Gluta-mic acid	Глу	Glu	НООС(СН2)2- CH(NH2) сбои	147,1	3,22	1	14	-	249
Глутамин	Gluta-mine	Глн	Gin	H2N(O)C(CH2)2- CH(NH2) соон	146,1	5,65	3	-	-	185
Основные аминокислоты
+Лизин	Lysine	Лиз	Lys	H2N(CH2)3-CH(NH2) соон	146,2	9,74	-	-	-	224
± Аргинин	Argi-nine	Apr	Arg	H2NC(=NH) NH(CH2)3-CH(NH2) соон	174,2	10,7	15	-	-	238
± Гистидин	Histi-dine	Гис	His		155,2	7,58	0,4	-	-	277

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В химический стакан вносят точно 1 мл анализируемого препарата (питательной среды или гидролизата), затем приливают 10 мл воды. Доводят pH раствора до значения pH 7 потенциометрически, по рН-метру, используя для этого 0,05 М, 0,1 М, 0,2 М растворы гидроксида натрия и серной кислоты (концентрация растворов определяется наличием карбоксильных групп).

В отдельной емкости нейтрализуют примерно 20 мл 37%-ного формалина потенциометрически до значения pH 7.0. Для нейтрализации используют те же растворы NaOH и H₂SO₄.

В химический стакан с препаратом опускают электроды рН-метра, приливают 6 мл свеженейтрализованного формалина. Значение pH при этом сдвигается в кислую сторону из-за освобождения карбоксильных —СООН групп после взаимодействия формалина с аминогруппами. Не вынимая электроды из стакана, пробу титруют 0,1 М раствором NaOH при перемешивании до значения pH 9,1.

Параллельно проводят контрольный опыт, где вместо препарата берут 1 мл воды (холостая проба). Титрование проводится потенциометрически.

РАСЧЕТ

Содержание аминного азота X (в граммах аминного азота на 100 мл раствора препарата) рассчитывают по формуле:

Х=(А—В)К - 1,4- 100/Y,

где: А — количество 0,1 М раствора NaOH, пошедшего на титрование пробы, мл; В — количество 0,1 М раствора NaOH, пошедшего на титрование контроля (холостой пробы), мл; К — поправка к титру 0,1 М раствора NaOH (К = 1 при использовании точно титрованного 0,1 М раствора NaOH);

1,4 — количество азота (в мг), эквивалентное точно 1 мл пробы; Y — объем пробы, взятой на определение, мл; 100 — пересчет на 100 мл пробы.

Для оценки содержания свободных аминогрупп в пептидно-аминокислотных объектах, выраженное в процентах, определение азота свободных аминогрупп можно проводить следующим образом. 1 мл анализируемого препарата, содержащего около 35 мг/мл свободных аминокислот, разбавляют смешением с 49 мл дистиллированной воды, прибавляют 10 капель 1 %-ного раствора фенолфталеина и титруют 0,1 М раствором гидроксида натрия до появления слабо розовой окраски. После этого прибавляют 10 мл раствора формальдегида, нейтрализованного по фенолфталеину до обесцвечивания. Затем титруют 0,1 М раствором №()Н до появления розовой окраски.

Раствор формальдегида (формольную смесь) готовят перед проведением анализа смешиванием 50 мл технического формалина с 1 мл 1%-ного раствора фенолфталеина и 0,1 М раствором №()Н доводят окраску смеси до слабо розового окрашивания.

Содержание азота свободных аминогрупп (Х,%) рассчитывают по формуле:

Х= (А - В) ? К - 0,0014 ? 100 /У,

где: А — количество 0,1 М раствора а()Н. пошедшего на первое и второе титрование пробы, мл; В — количество 0,1 М раствора а()Н. пошедшего на первое титрование, мл; К — поправка к титру 0,1 М раствора а()Н (К= 1 при использовании точно титрованного 0,1 М раствора а()Н); 0,0014 — количество азота в граммах, соответствующее 1 мл 0,1 М раствора а()Н; У — количество испытуемого раствора, взятого при определении, мл; 100 — пересчет на 100%.

Содержание азота для указанной концентрации свободных аминокислот в 30 мг/мл и пептидов составляет от 0,3 до 0,9% (от 3 до 9 мг/мл).

Результат представляют с точностью до десятого знака после запятой.

Ошибка определения составляет ±15% определяемой величины.

АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ

Индивидуальные аминокислоты в растворе или в смесях могут быть разделены методом тонкослойной хроматографии. Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органический растворитель, например смесь бутанола с уксусной кислотой. Водная фаза является неподвижной, так как вода в данном случае оказывается сорбированной на инертном носителе — бумажной целлюлозе, которая в закрытой хроматографической камере в насыщенной влажной атмосфере удерживает до 20% воды. Подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель.

В зависимости от растворимости аминокислоты в воде или органическом растворителе наблюдается разная скорость движения аминокислот при смачивании бумаги с нанесенным на нее для анализа образцом. Для усиления видимости пятен, соответствующих аминокислотам, храматограмму «проявляют», то есть обрабатывают веществом, окрашивающим пятна. Наиболее часто для этих целей применяют нингидрин.

Типичная хроматограмма после окрашивания представляет собой полоску бумаги, на которой слабо просматривается стартовое пятно и хорошо видны пятна индивидуальных аминокислот, которые располагаются выше старта.

Местоположение вещества на хроматограмме зависит от коэфици-ента распределения а: а = [концентрация вещества в подвижной фазе] / [концентрация вещества в неподвижной фазе].

Для характеристики положения пятна с веществом применяют величину R_f — коэффициент скорости движения (retention factor — фактор удерживания): R_f = [расстояние, пройденное аминокислотой от старта, мм] / [расстояние, пройденное фронтом растворителя от старта, мм].

R_f является характерной постоянной для данного вещества и зависит от качества применяемого растворителя, его состава, pH, температуры, плотности бумаги и других факторов. Если указаны условия определения и значение R_f, то можно точно указать, о каком веществе идет речь (табл. 8.4).

Метод является простым и широко используется для определения аминокислот и других органических веществ в количествах от десятых до сотых долей миллиграмма.

Чувствительность метода 2—5 мкг индивидуального вещества в одном пятне.

ОБОРУДОВАНИЕ

Пинцет, хроматографическая камера, бумага для хроматографии или хроматографические пластинки типа Silufol, стеклянный капилляр, ножницы, сушильный шкаф на 70 °C, пульверизатор.

РЕАКТИВЫ

Бутиловый спирт хч или чда, уксусная кислота ледяная х.ч., вода дистиллированная (готовят заранее смесь для хроматографирования), 0,5%-ный раствор в ацетоне, смесь аминокислот: например, глютаминовая кислота — 60 мг, аланин — 40 мг, глицин — 40 мг, растворенные в 10 мл дистиллированной воды (можно использовать раствор смеси по 50 мг других аминокислот в 10 мл воды).

ХОД РАБОТЫ

Вырезают полоску хроматографической бумаги длиной в 15 см и шириной в 1,5 см. Можно использовать специальные пластинки 8Пп1Ь1 или Merck для тонкослойной хроматографии. Размеры вырезаемой полоски должны соответствовать размерам хроматографической камеры.

Приготавливают хроматографическую камеру, которая представляет собой большую пробирку с пробкой, цилиндр с притертой крышкой или специальную прямоугольную стеклянную камеру, герметично закрываемую сверху притертым стеклом. На дно камеры заливают 2 мл смеси бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5 и закрывают крышкой.

На полоске бумаги карандашом ставят черточку примерно в 2 см от нижнего края и капилляром наносят касанием 1 каплю испытуемой смеси.

Пластинке дают подсохнуть над горячей поверхностью плитки или сушильного шкафа и повторяют процедуру касания капилляром 3 раза. Место нанесения пробы не должно соприкасаться с растворителем при помещении полоски бумаги в хроматографическую камеру (карандашная полоска должна быть на 0,5 см выше слоя растворителя).

Пинцетом опускают вертикально в камеру полоску бумаги нижним краем в растворитель и закрывают камеру. Процесс хроматографирования проводят в течение 1—2 ч. При этом происходит продвижение вверх фронта растворителей и разделение аминокислот. Хроматограмму извлекают из камеры, отмечают границу продвижения фронта растворителя (карандашом или надрезанием края бумаги) и высушивают под тягой.

На высушенную хроматограмму наносят пульверизатором или осторожным смачиванием путем погружения 0,5%-й раствор нингидрина в ацетоне и подсушивают на воздухе. При смачивании не допускать подтеков.

Проявление хроматограммы проводят, нагревая полоску бумаги в сушильном шкафу при температуре 70 °С в течение 15 мин.

Идентификацию аминокислот осуществляют по найденным значениям Для этого линейкой замеряют расстояния пробега фронта растворителя и каждого отдельного пятна соответствующей аминокислоты от места нанесения пробы, выраженные в мм. Определяют коэффициент пробега и фактор разделения Ж, значения которых сравнивают с табличными данными.

Таблица 8.4

Значения Кг аминокислот в системе растворителей бутанол: уксусная кислота: вода 4:1:5 (при температуре 20 °С)

По значениям И) проводят точную идентификацию наличия конкретных аминокислот в анализируемой смеси.

АМИНОКИСЛОТНЫЙ АНАЛИЗ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНЫХ И СВЯЗАННЫХ В БЕЛКЕ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АВТОМАТИЧЕСКОГО АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗАТОРА

ОБОРУДОВАНИЕ

Анализатор аминокислот LC3000 с компьютером фирмы Eppendorf-Biotronic (Германия) или другой прибор подобного класса с автоматическим термостатируемым устройством ввода пробы и баллоном со сжатым Не или N₂ квалификации «ОСЧ для хроматографии». Пластиковые пробирки для проб вместимостью 0,5 мл. Устройство в виде фильтра «in line», надеваемого на шприц, или воронка с колбой для вакуумного фильтрования растворов через фторопластовый фильтр с номинальным размером пор 0,22 мкм производства Millipore (США). Автоматические пипетки на 10—1000 мкл для разбавления проб. pH-метр с точностью определения ±0,001 единицы pH в интервале pH 1 — 14. Установка для кислотного гидролиза белков, представляющая собой термостат на 120 °C, в который помещают запаиваемые на газовой горелке стеклянные ампулы или толстостенные пробирки «Pirex» (США) с плотно завинчивающимися тефлоновыми пробками, удерживающими давление паров НС1. Аналитические весы типа «Sartorius» (Германия) с точностью взвешивания ±0,00001 г. Устройство для заполнения ампул инертным газом, представляющее собой баллон с Аг с редуктором и барбатажной трубкой или то же с устройством для вакуумирования и заполнения Аг замороженных при —70 °C ампул. Роторный испаритель типа Rotavapor R-144, «Buchi» (Швейцария) с вакуумным насосом для отгонки водных растворов НС1. Центрифуга 8000 G. Измельчитель белковых проб, ступка, стаканы, колбы, пробирки.

РЕАКТИВЫ

Этиловый спирт, хлороформ, соляная кислота 6 М раствор и концентрированная, о-фосфорная кислота, вода бидистиллированная (безаминокислотная для хроматографии), цитрат натрия, тиодигликоль, каприловая кислота, трихлоруксусная кислота, ацетат натрия, метанол, муравьиная кислота, уксусная кислота, борная кислота, этилендиаминтетраацетата динатриевая соль, гидроксид натрия, вода для HPLC, нингидрин, гидридантингидрат, метилцеллозольв. Все реактивы только квалификации «х.ч.», «осч» или «для хроматографии». Стандартный раствор, содержащий по 2,5 мкМоль/мл ASP, THR, GLU, PRO, GLY, ALA, CYS, VAL, MET, ILEY, LEY, TYR, PHE, HIS, LYS и ARG.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Анализ содержания аминокислот выполняют на аминокислотном анализаторе типа LC3000 фирмы Eppendorf-Biotronic (Германия). Для разделения аминокислот используют буферную систему в соответствии с нормативной документацией, приложенной к анализатору, рекомендуемый состав компонентов буферных растворов указан в табл. 8.5. pH буферных растворов устанавливают с помощью орто-фосфорной кислоты и гидроокиси натрия, растворы перед введением в анализатор подвергают фильтрованию через фторопластовый фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Принцип определения аминокислот заключается в следующем. 20 мкл анализируемой пробы помещают в пластиковый сосуд, который устанавливают в поворачивающийся штатив автоматического термостатированного инжектора. Закол пробы осуществляется в соответствии с программой после промывки и регенерации хроматографической колонки, имеющей температуру 47 °С и заполненной ионообменником, катионитом марки ВТХ—С с карбоксильными ионогенными группами в №+-форме. Подача элюента осуществляется по капиллярным шлангам высокого давления с внутренним диаметром 0,2 мм. Разделение аминокислот осуществляется автоматически в соответствии с заданной программой. После разделительной колонки раствор поступает в термостатированный реактор для проведения цветной реакции. Подача в реактор нингидринового раствора, содержащего: 15 г/л нингидрина, 0,55 г/л гидридантингидрата, 1% метил-целлозольва, 10% метанола в 0,1М ацетатном буфере pH 4,8, позволяет при температуре реактора 125 °С осуществлять цветную реакцию анализируемых и прошедших аминокислот с нингидрином. Далее окрашенный раствор с комплексом аминокислот с нингидрином подается насосом в УФ детектор. Запись хроматограмм, после введения в хроматограф автосамплером или микрошприцем 20 мкл пробы осуществляют автоматически в соответствии с инструкцией по эксплуатации аминокислотного анализатора. Регистрацию аминокислот, связанных в комплексе с нингидрином, осуществляют автоматически при 570 нм, пролин и оксипролин анализируют соответственно при 440 нм.

Работа анализатора выполняется по программе, предусматривающей ступенчатое изменение вида буфера и температуры хроматографической колонки на каждой стадии. Стандартное время анализа от момента ввода пробы до завершения выхода последнего пика, соответствующего аргинину, составляет 50 минут при скорости подачи элюента 0,22 мл/мин. Основные параметры программы анализа аминокислот приведены в табл. 8.5.

Используемый метод позволяет определять с точностью ±(5—10)% наличие до 17 аминокислот с минимальным уровнем их содержания в растворе (0,500 ± 0,006) мкмоль/мл. Минимальный интервал надежного определения сигнала аминокислот, составляющий > 200 мВ, получают для концентрации >0,3 мкг/мл взятого на анализ белка в пробе.

Полный аминокислотный состав белков определяют в гидролизате, полученном по стандартной методике обработкой 6 М раствором НС1 при температуре 120 °С в течение 24 ч в токе Аг с последующей троекратной отгонкой летучих компонентов досуха и окончательным растворением пробы в буфере с pH 2,2, содержащем: цитрата натрия

9,8 г, концентрированной HCl 8,3 мл, тиодигликоля 1 мл и каприловой кислоты 50 мкл на литр.

Свободные аминокислоты определяют в продукте после его обработки добавлением 10% об. трихлоруксусной кислоты для осаждения белков, нейтрализацией до pH 2.0, фильтрацией через мембранный фильтр типа Миллипор с номинальным диаметром пор 0,22 мкм с последующим разбавлением фильтрата в буфере для растворения проб pH 2,2.

Количественную оценку содержания отдельных аминокислот проводят путем сравнения площадей пиков на аминограмме, рассчитанных с помощью интегрирующих систем, например Winpeak фирмы Eppendorf-Biotronic (Германия) или другой аналогичного уровня, с площадями пиков, полученных при анализе стандартной смеси аминокислот, содержащей например 2,5 мкмоль каждой аминокислоты в 1 мл стандартного раствора.

Содержание аминокислоты (X) в мкМ/мл (или в мг/мл,%, условных машинных единицах или мм по высоте пиков в соответствии с заданной автоматической программой компьютерного обсчета хроматограмм) осуществляют автоматически по формуле:

Х= Si/Sr С,

где Si — площадь пика определяемой аминокислоты на аминограмме; S₂ — площадь пика той же аминокислоты в стандартной смеси; С — концентрация аминокислоты в стандартной смеси, мкМ/мл.

Таблица 8.5

Состав буферных растворов (А—Б) для аминокислотного анализатора

Результаты определения рассчитывают до второго десятичного знака, и округляют до первого десятичного знака после запятой.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Точность определения в параллельных опытах по отдельным аминокислотам составляет от ±10 до ±20%, воспроизводимость в независимых определениях составляет от ±20 до ±40%. Для Трп, Про, Цис и Мет воспроизводимость в независимых определениях составляет от ±40 до ±65%.

Типичный аминокислотный состав животного белка может быть записан в (г/100г белка): TAU - 0.2, ASP - 9.2, THR - 3.5, SER - 3.6, GLU - 19.6, PRO - 3.7, GLY- 6.0, ALA - 5.2, CYS - 1.1, VAL - 4.9, MET - 1.9, ILEY - 3.6, LEY - 6.2, TYR - 3.9, PHE - 3.7, HIS - 3.8, OPN - 0.1, LYS - 7.5, ARG - 7.7 (всего 95.4 г/100г белка). Запись в скобках показывает реально получаемую степень гидролиза белка, которая теоретически может составлять до 118% (масс.) за счет присоединения воды при разрыве пептидных связей.

Аминокислотный состав некоторых объектов представлены в табл. 8.6.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ

Проводят по следующей методике. 5 г образца мяса или рыбы последовательно растирают в ступке с 50, 25 и 15 мл 96%-ного этанола, разделяя осадок и надосадочную жидкость на центрифуге (6000 об/мин, 15 мин, О = 60).

Таблица 8.6

Аминокислотный состав различных продуктов, г/100 г белка

* Е/Т — соотношение заменимых аминокислот к общему количеству содержащихся в белке аминокислот.

Экстракцию растертого образца повторяют последовательно 80% и 50% водным этанолом. Отделенные центрифугированием водноспиртовые экстракты от всех экстракций объединяют и подвергают троекратному экстрагированию (1:5) хлороформом. Хлороформный слой, содержащий спирт, отбрасывают. Водную вытяжку упаривают в вакууме на роторном испарителе, типа системы Во1аарог И-144. «ВисЫ» (Швейцария) досуха. К сухому остатку добавляют 60 мл цитратного буфера pH 2,2 для последующего автоматического аминокислотного анализа по программе (табл. 8.7), который проводят аналогично описанному выше.

Содержание аминокислоты (X) в мкМ/мл (в мг/мл или в% в соответствии с заданной автоматической программой компьютерного обсчета хроматограмм) осуществляют автоматически по формуле:

Х = 8!/8₂-С,

где: — площадь пика определяемой аминокислоты на аминограмме; 8₂ — площадь пика той же аминокислоты в стандартной смеси; С — концентрация аминокислоты в стандартной смеси, мкМ/мл.

Результаты определения (табл. 8.8) рассчитывают до второго десятичного знака, и округляют до первого десятичного знака после запятой.

Таблица 8.7

Программа анализа содержания аминокислот (давление в колонке 50—60 бар, поток 0,22 мл/мин)

Таблица 8.8

Содержание свободных аминокислот и полный аминокислотный состав некоторых пищевых продуктов

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Точность определения в параллельных опытах по отдельным аминокислотам составляет от ±10 до ±20%, воспроизводимость в независимых определениях составляет от ±20 до ±40%. Для Трп, Про, Цис и Мет воспроизводимость в независимых определениях составляет от ±40 до ±65%.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТРИПТОФАНА

Триптофан является незаменимой аминокислотой. Уровень содержания Трп в продуктах животного, растительного или рыбного происхождения колеблется в пределах 0,01—0,5 г на 100 г массы (в среднем — около 0,2% масс, для объектов животного происхождения с содержанием белка в 20%).

Учитывая, что триптофан является достаточно неустойчивым органическим соединением и, в случае проведения полного кислотного гидролиза белков в присутствии 6 М НС1 по стандартной методике подвергается существенному разложению, целесообразно использовать для его количественного определения метод щелочного гидролиза.

МЕТОД АНАЛИЗА триптофана щелочным гидролизом основан на обработке объекта щелочью с последующим проведением цветной реакции с п-диметиламинобензальдегидом и измерении развивающейся окраски на спектрофотометре при 610 нм. Чувствительность метода составляет около 1 мкг/мл, диапазон измеряемых концентраций 2—8 мкг/мл. Щелочной гидролизат может быть проанализирован по стандартной программе на аминокислотном анализаторе.

ОБОРУДОВАНИЕ

Колба с обратным холодильником для гидролиза вместимостью 100 мл, спектрофотометр или фотометр с X = 610 нм с кюветами 1 см, мерные колбы вместимостью 50 и 100 см³, мерные пипетки. рН-метр.

Аминокислотный анализатор типа LC3000 фирмы Eppendorf-Biotronic (Германия). Ампулы для гидролиза или герметизируемые пробирки Пирекс. Термостат на ПО °С.

РЕАКТИВЫ

3 М раствор NaOH. 6 М и 1 М раствор H₂SO₄.2%-ный раствор NaNO3. Концентрированная НС1 хч. 50%-ный водный этанол. Триптофан химически чистый с содержанием основного вещества не менее 95%.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИПТОФАНА ЦВЕТНОЙ РЕАКЦИЕЙ

До начала определения Трп в образцах с высоким содержанием жиров, необходимо провести их обезжиривание экстракцией диэтиловым эфиром или ацетоном в аппарате Сокслета.

Навеску образца, содержащего из расчета 100—250 мг белка (при содержании белка в образце 5% навеска составляет 2 г), смешивают в колбе для гидролиза с 4 мл дистиллированной воды и 20 мл 3 М раствора NaOH.

Содержимое кипятят в течение 2 ч от начала кипения в колбе с обратным холодильником.

Гидролизат нейтрализуют добавлением в начале 6 М раствора H₂SO₄ и в конце 1 М раствора H₂SO₄ до pH 6,5—7,0 количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³ и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор фильтруют, если необходимо дважды, от образовавшегося после гидролиза осадка кремниевой кислоты.

Таблица 8.9

Разбавление стандартного раствора триптофана

Для проведения цветной реакции в колбе вместимостью 100 см³ смешивают 1 мл нейтрализованного прозрачного гидролизата с 0,5 мл 2,5%-ного раствора п-диметиламинобензальдегида в 10%-ном растворе НС1 или H₂SO₄ при очень энергичном встряхивании, добавляют 0,2 мл 2%-ного раствора NaNO₃, перемешивают и осторожно добавляют 28 мл концентрированной НС1 и оставляют при комнатной температуре в течение 30 мин для развития окраски. Доводят объем раствора до метки 50%-ным этанолом.

Параллельно проводят холостой опыт, заменяя гидролизат 1 мл дистиллированной водой. Интенсивность синей окраски измеряют на фотометре при длине волны 610 нм в кювете толщиной 10 мм.

По величине оптической плотности на градуировочном графике зависимости оптической плотности от концентрации Трп, находят концентрацию Трп в объеме жидкости, взятой для цветной реакции (рис. 8.3).

Рис. 8.3. Зависимость оптической плотности D610 окрашенного комплекса с п-диметиламиобензальдегидом от содержания Трп в растворе.

Для построения градуировочного графика навеску 50 мг стандартного образца химически чистого Трп растворяют в 20 мл 3 М раствора NaOH и полученный раствор обрабатывают по всем описанным стадиям до проведения цветной реакции, получая раствор с содержанием Трп — 1 мг/мл. После этого готовят не менее 5 стандартных растворов с содержанием Трп 1—6 мкг/мл в соответствии с табл. 8.9 разбавления.

Массовое содержание Трп Хв% вычисляют:

X = иц ? 50 ? 10^-6 ? 100/V-g,

где: Ш] — масса Трп в исследуемом растворе, найденная по градуировочному графику, мкг; 50 — объём раствора после нейтрализации и разведения, мл; 10“⁶ — коэффициент перевода мкг в г; 100 — коэффициент перевода в процентную концентрацию; V — объем раствора, взятый для цветной реакции, мл; g — навеска образца, взятого на анализ, г.

Результаты определения рассчитывают до второго десятичного знака, и округляют до первого десятичного знака после запятой.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Точность определения в параллельных опытах ±20%, воспроизводимость в независимых определениях ±60%.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИПТОФАНА НА АМИНОКИСЛОТНОМ АНАЛИЗАТОРЕ

Навеску обезжиренного образца, содержащую около 30 мг белка, помещают в ампулу для гидролиза (можно использовать герметизируемые пробирки Пирекс с завинчивающимися тефлоновыми пробками), добавляют 10 мл 2 М раствора NaOH. Ампулу запаивают и помещают в термостат с температурой (110 ± 2)°С и выдерживают в течение 12 ч, периодически встряхивая.

Гидролизат количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, смывая ампулу дистиллированной водой, добавляют 10 мл раствора, содержащего 1,23 г лимонной кислоты и 0,7 мл концентрированной НС1 и доводят объем до метки. Аликвоту полученного раствора используют в автоматическом анализе на аминокислотном анализаторе, разбавляя, в случае необходимости, цитратным буфером с pH 2,2, используемым в стандартном аминокислотном анализе до концентрации по белку 0,0003 мг/мл. Величина сигнала детектирования при такой концентрации составляет 50—100 мВ на анализаторе типа LC3000 фирмы Eppendorf-Biotronic (Германия).

Массовую долю аминокислоты X в мг на 100 г образца, взятого на гидролиз, определяют по автоматической программе расчета хроматографических данных или по формуле:

Х=ш-Р- IO“⁶- 100/V-g,

где ш — массовая доля аминокислоты в объеме вводимой пробы, нг; Р — общее разведение с учетом аликвоты; 10^-6 — коэффициент перевода нг в мг;100 — коэффициент перевода в процентную концентрацию; V — объем вводимой пробы, мл; g — навеска образца, взятого на гидролиз, г.

Результаты определения рассчитывают до второго десятичного знака, и округляют до первого десятичного знака после запятой.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных определений. Точность определения в параллельных опытах ±15%, воспроизводимость в независимых определениях ±30%.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОКСИПРОЛИНА

Метод основан на получении свободного оксипролина в растворе в результате кислотного гидролиза пробы с последующим проведением цветной реакции с п-диметиламинобензальдегидом и измерении интенсивности развивающейся окраски.

Чувствительность метода 5 мкг/мл. Диапазон измеряемой концентрации в исследуемом растворе 5—25 мкг/мл.

ОБОРУДОВАНИЕ

Ампулы для гидролиза или герметизируемые пробирки Пирекс. Термостат на 120 °С. Спектрофотометр или фотометр с 7. = 560 нм с кюветами 1 см. Мерные колбы вместимостью 50 и 100 см³. Мерные пипетки. рН-метр. Пробирки.

РЕАКТИВЫ

Гидроксид натрия хч, 6 М и 2,5 М растворы. 4% свежеприготовленный раствор Н₂О₂. Мочевина чда, 0,1 М раствор. Концентрированная НС1, хч. Сульфат меди (11) хч, 0,5 М раствор CuSO₄ ? 5Н₂О. Серная кислота хч, 4 М раствор H₂SO₄. 5%-ный раствор перекристаллизованного п-диметиламинобензальдегида в изопропаноле. Оксипролин химически чистый с содержанием основного вещества не менее 95%.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

В ампулу вносят навеску обезжиренного образца из расчета 0,4 г белка (при содержании в образце белка 10% навеска составляет 4 г), добавляют 7 мл дистиллированной воды, 0,7 г SnCl₂ ? 2Н₂О и 10 мл концентрированной соляной кислоты. Ампулу запаивают и выдерживают в термостате при температуре 120 ± 2 °С в течение 6 ч.

Содержимое ампулы переносят количественно в мерную колбу вместимостью 100 см³, раствор нейтрализуют добавлением 6 М раствора NaOH до образования белого осадка и 2,5 М раствором NaOH до pH 8,2. Охлажденное до 20 °С содержимое колбы доводят до метки и оставляют на 16 ч. Раствор фильтруют, из фильтрата параллельно отбирают две пробы в количестве по 1 мл. Одновременно в две другие пробирки помещают по 1 мл воды (контроль). В каждую из четырех пробирок последовательно прибавляют по 0,5 мл 0,5 М раствора сернокислой меди, 0,5 мл 2,5 М раствора NaOH и 0,2 мл 4%-ного раствора Н₂О₂, пробирки встряхивают и в течение 10 мин выдерживают при

70 °С, периодически перемешивая. Растворы охлаждают и добавляют к ним 0,1 мл 0,1 М раствора мочевины. Содержимое пробирок перемешивают и через 10 мин добавляют 0,5 мл 4 М раствора Н₂8О₄ и 2,5 мл 5%-ного раствора перекристаллизованного п-диметиламинобензаль-дегида в изопропаноле. Пробирки термостатируют при 70 °С в течение 20 мин и после охлаждения определяют оптическую плотность растворов при длине волны 560 нм в кювете толщиной 10 мм против контроля.

По величине оптической плотности на градуировочном графике зависимости оптической плотности от концентрации оксипролина, находят концентрацию Опр в объеме жидкости, взятой для цветной реакции.

Для построения градуировочного графика (рис. 8.4) готовят раствор стандартного образца химически чистого оксипролина с содержанием Опр — 1 мг/мл. После этого готовят не менее 5 стандартных растворов с содержанием Опр: 5, 10, 15, 20 и 30 мкг/мл. Для этого в мерные колбы вместимостью 50 см³ вносят по 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 основного стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл соответственно и доводят объемы до метки. Берут аликвоту в 1 мл каждого рабочего стандартного раствора и проводят цветную реакцию как указано выше.

Измеряют значения оптических плотностей против контроля и строят градуировочный график.

Рис. 8.4. Зависимость оптической плотности окрашенного комплекса с п-диметиламинобензальдегидом от содержания оксипролина в растворе

РАСЧЕТ

Содержание Опр (Х,%) вычисляют:

Х = ш,-100- 10^-6 ? ЮО/У^,

где: Ш] — масса Опр в исследуемом растворе, найденная по градуировочному графику, мкг; 100 — объём колбы для разведения, мл; 10^-6 — коэффициент перевода мкг в г; 100 — коэффициент перевода в процентную концентрацию; V — объем раствора, взятый для цветной реакции, мл; g — навеска образца, взятого на анализ, г.

Результаты определения рассчитывают до второго десятичного знака, и округляют до первого десятичного знака после запятой.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Точность определения в параллельных опытах ±15%, воспроизводимость в независимых определениях ±40%.