Лиофилизация (сублимация)
Лиофилизация — метод высушивания глубоко замороженных образцов путем возгонки (сублимации) воды в вакууме.
ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА
Процесс лиофильной сушкиосуществляют в вакууме при пониженных темературах. При температуре выше 273,16 К (0,01 °С) вода может существовать одновременно только в жидком и газообразном состояниях. Фазовый переход из жидкого состояния в газообразное называется испарением. При температуре ниже 273,16 К вода существует только в твердом и газообразном состоянии. Фазовый переход из твердого состояния в газообразное называется сублимацией. Интервал 220—273 К соответствует истинному давлению пара при сублимации. Все три фазовых состояния могут существовать одновременно только при 273,16 К, поэтому эту точку называют «тройной точкой».
Давление паров над поверхностью льда снижается при падении температуры и при 253 К (—20 °С) составляет всего 100 Па. При удалении паров воды из пространства над поверхностью льда или замороженного раствора происходит интенсивное испарение льда. Этот процесс сопровождается потерей части энергии льдом, в результате чего температура льда снижается, и на протяжении всего периода возгонки (сублимации) образец остается в глубоко замороженном состоянии. Температура образца при этом определяется давлением пара надо льдом. Для осуществления лиофилизации весьма важно, чтобы на протяжении всего процесса в установке поддерживалось низкое давление.
Низкое давление поддерживают, при помощи ротационного масляного насоса. Однако этот процесс экономически нерентабелен, так как образующийся водяной пар занимает слишком большой объем. Наиболее эффективной ловушкой паров воды служит конденсатор льда, имеющий развитую, сильно охлаждаемую поверхность. В этом случае конденсация водяных паров идет эффективно и давление над образцом сохраняется достаточно низким. Вакуумный насос служит только для удаления небольших количеств воздуха из образца или воздуха, просачивающегося в систему за счет отдельных неплотностей. Для поддержания необходимого давления используют также масляный насос. Процесс высушивания протекает быстро, если парциальное давление неконденсируемого газа (воздушной смеси) не превышает 100 Па. При давлении выше 100 Па молекулы воды имеют ограниченную подвижность, процесс лиофилизации затруднен. При давлении 1 Па процессы испарения воды из образца и ее конденсации в ловушке протекают равномерно.
Скорость лиофильного высушивания зависит не только от давления паров, которое должно поддерживаться на минимальном уровне. Большое значение имеет компенсация энергии, затраченной на сублимацию льда. Это обеспечивается прямым контактом, обогревом путем облучения, конверсией. Процесс лиофилизации вещества подразделяется на три этапа: замораживание образца до температуры, определяемой остаточным давлением в системе; возгонка; подсушивание образца.
Основной процесс — возгонка начинается, как только в испарителе достигается рабочий вакуум (остаточное рабочее давление). Процесс заканчивается при полном испарении льда. Подсушивание образца необходимо только в том случае, если последний имеет слишком высокую остаточную влажность, нежелательную при последующем хранении. В этом случае образец высушивают с использованием диффузионного насоса (~ 10 Па) или над Р2О5 в вакууме.
ПРИБОРЫ
Лиофилизацию проводят в специальных приборах, которые состоят из нескольких функциональных блоков.
Камера для образца. Образцы размещают в лотках, чашках и др. емкостях, стоящих на полке. Полку можно нагревать (нагреватель с плавной регулировкой нагрева) или охлаждать. Камера имеет насадку («зонтик»), на которой можно разместить множество круглодонных колб. Эти колбы отличаются от обычных круглодонных колб тем, что вместо конического шлифа имеют сферический внешний шлиф-керн. Такая конструкция исключает загрязнение образца вакуумной смазкой при извлечении высушенного вещества из колбы.
Конденсатор (охлаждаемая ловушка). Наиболее эффективным конденсатором водяных паров является охлаждаемая извне поверхность. От степени охлаждения конденсатора зависит парциальное давление паров воды и, как следствие, остаточная влажность препарата. Емкость конденсатора определяется площадью охлаждаемой поверхности. В зависимости от конструкции ловушки объемы высушиваемых образцов варьируются от 50 до 200 мл.
Холодильный агрегат. Только в небольших лабораторных установках конденсатор (ловушку) замораживают охлаждающей смесью — жидким азотом или сухим льдом. На предприятиях применяют холодильные агрегаты, которые делают возможным непрерывное производство. Во многих случаях используются одноступенчатые холодильники (максимальное охлаждение до 230 К). Для более глубокого замораживания используют двухступенчатые агрегаты, способные поддерживать температуру ниже 200 К. Холодильные агрегаты должны иметь достаточно высокую производительность, чтобы при высокой скорости возгонки обеспечивать быструю конденсацию и замораживание водяных паров.
Вакуумный насос. Небольшое количество водяных паров не улавливается охлаждаемой ловушкой. Эти пары и всегда имеющиеся в системе сопутствующие газы должны удаляться ротационным насосом с достаточно высокой, производительностью. Большинство установок снабжены дополнительным диффузионным масляным насосом, с помощью которого осуществляют досушивание (при отключенной ловушке) образца.
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА
Способ замораживания и необходимая температура лиофилизации зависят от свойств высушиваемых веществ, а также от размера и формы сосуда для лиофилизации. Некоторые вещества могут быть высушены уже при 260 К, другие, с более высоким содержанием солей, при 230 К.
Образец может быть лиофилизован в круглодонных колбах или в открытых сосудах.
Колбы для лиофилизации отличаются от обычных круглодонных колб тем, что вместо конического шлифа имеют сферический внешний шлиф-керн. Такая конструкция исключает загрязнение образца вакуумной смазкой при извлечении высушенного материала из колбы.
Перед замораживанием колбу с образцом прикрывают бумажной салфеткой, чтобы воспрепятствовать уносу высушенного вещества в конденсатор.
При лиофилизации фиксируют салфетку в керне упругой пружинкой и избыточный материал обрезают.
В случае использования лотков, чашек, стаканчиков, пробирок салфетка прикрепляется липкой лентой. Сосуд можно также закрыть термопластичной пленкой парафильм, в которой затем проделывают сеть тонких отверстий с помощью иглы.
Замораживание образца проводят в бане с хладоагентом (жидкий азот, ацетон — сухой лед) или непосредственно в камере.
Ампулы или чашки заполняют слоем раствора толщиной не более 2 см, после чего их устанавливают на полку камеры и там охлаждают до 240К.
Круглодонные колбы с образцом вращают на рамках или валках и одновременно охлаждают. При этом раствор равномерно распределяется тонким слоем по стенкам сосудов. О полном замораживании свидетельствует потрескивание слоя льда.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ОПЕРАЦИЙ
Устанавливают сосуды и чашки в камеру. После снижения давления до 100 Па круглодонные колбы закрепляют на насадке («зонтик»)
Круглодонные колбы с замороженными образцами присоединяют вращательным движением к кернам «зонтика», слегка прижимают (перед этим шлиф необходимо тщательно очистить и правильно смазать), а затем открывают кран на керне. Колбы удерживаются на керне самостоятельно лишь после вакуумирования. Перед тем как присоединить очередную колбу, необходимо убедиться, что в закрепленных колбах достигнута температура возгонки, по этому признаку судят и о глубине вакуума в системе.
Начало лиофилизации можно проконтролировать через некоторое время следующим образом: при помощи запорного крана отключают камеру-испаритель от ловушки. Через некоторое время (несколько секунд) определяют уровень давления в испарителе. В начале лиофилизации давление немного повышается, или при нормальном течении процесса несколько падает и после завершения сушки практически не изменяется.
По окончании лиофилизации систему (осторожно!) разгерметизируют и разбирают. Сосуд с образцом герметично закрывают или помещают в эксикатор, поскольку тонкодисперсные лиофилизованные препараты часто бывают гигроскопичны и расплываются на воздухе.
При необходимости образец дополнительно высушивают в рабочей камере. Для этого перед включением диффузионного насоса камеру отключают от конденсатора. Менее эффективным, но более часто встречающимся приемом является подсушивание образца над Р2О5 в вакуум-эксикаторе.
ОСОБЫЕ СЛУЧАИ
Нерастворимые в воде твердые вещества методом лиофильного высушивания часто удается перевести в порошкообразное состояние. Этот прием чрезвычайно удобен при работе с ультрамикроколичеством вещества. Вначале вещество растворяют в минимальном объеме н-бутанола, затем добавляют 2—3-кратный объем воды и быстро замораживают. После лиофилизации вещество представляет собой тонкодисперсный порошок.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Мягкое высушивание лабильных веществ с сохранением их свойств (структуры, ферментативной активности, бактериостатических свойств).
Работа с ультрамикроколичествами вещества.
Возможность длительного сохранения лиофильно высушенных образцов.
Применение в области клинических исследований: препараты ферментов, бумага и трубки для тестирования, плазма крови, препараты белков, антигены, антитела, гормональное препараты.
Применение в биохимии: белки и нуклеиновый кислоты.
Применение в химии: природные вещества и полимеры.
Применение в области гигиены и бактериологии: душистые вещества, антитоксины, антитела, сыворотки, препараты для определения группы крови, бактериальные культуры.
Применение в пищевой промышленности: сублимированные продукты, такие как чай, кофе, молоко, супы.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ И ЗАДАНИЯ К ГЛАВЕ 1
- 1. Какие методы используются для получения чистых веществ?
- 2. Почему применяется множество экспериментальных приемов для очистки веществ, какие важнейшие свойства при этом используются?
- 3. Какие из перечисленных методов позволяют очищать вещества от микробных загрязнений? Какие от химических примесей?
- 4. Можно ли данные методы использовать в промышленности?
- 5. Предложить схему очистки вещества до степени чистоты 99% с целью его последующего использования в качестве референс-стандарта.
ЛИТЕРАТУРА К ГЛАВЕ 1
Техника лабораторных работ: уч. пособие для студентов, обучающихся по специальности 020101.65 «Химия» и по направлению 240401.62 «Химическая технология и биотехнология» / сост. О. С. Ав-дякова. — Тольятти: ТГУ, 2010. — 84 с.
Неклюдов, А. Д., Иванкин, А. Н., Федотов, Г. Н. Практический курс по общей химии, биотехнологии и экологическим основам производств: Учебное пособие для студентов спец. 260300. — М.: МГУЛ, 2004. - 500 с.
Березин, Б. Д. Органическая химия. В 2 томах. Том 1. Учебник / Б. Д. Березин, Д. Б. Березин. — М.: Юрайт, 2016. — 314 с.
Алексеенко, В. А. Металлы в окружающей среде. Оценка экологогеохимических измерений. Сборник задач / В. А. Алексеенко, А. В. Су-воринов, Е. В. Власова. — М.: Логос, 2012. — 170 с.
Грандберг, И. И. Практические работы и семинарские занятия по органической химии / И. И. Грандберг, Н. Л. Нам. — М.: Юрайт, 2012. - 352 с.
