Определение бенз(а)пирена и других полициклических ароматических углеводородов

Метод основан на экстракции гексаном бенз(а)пирена и других полициклических ароматических углеводородов из неомыляемой фракции липидов из смеси, получаемой в результате обработки образцов спиртовым раствором щелочи с последующей хроматографической очисткой экстракта и количественной идентификацией с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофлуори-метрии, а также методом тонкослойной хроматографии.

Метод предназначен для анализа остаточных количеств полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах животного и другого происхождения.

ОБОРУДОВАНИЕ

Весы лабораторные общего назначения с погрешностью взвешивания не более 0,0002 г. Испаритель ротационный ИР-1М или другой аналогичного класса. Аппарат для встряхивания типа АВУ-бс. Микроизмельчитель ткани. Термостатируемая баня с регулируемым нагреванием 20—100 °С. Печь муфельная для нагревания >600 °С. Мешалка магнитная. Камера хроматографическая стеклянная 40 х 40 х 40 см с притертой крышкой. Пластины хроматографические стеклянные 20 х 20 см.

Воронка Бюхнера. Колбы перегонные вместимостью 100—1000 мл. Колбы каплевидные для вакуумной перегонки вместимостью 50—100 мл. Колбы мерные 2—50—2; 2—100—2; 2—500—2. Воронка В-56—80 ХС. Колбы конические плоскодонные вместимостью 50—1000 мл. Цилиндры мерные 1—50, 1 — 100, 1—250. Пробирки с притертыми пробками вместимостью 10 см³. Аллонж вакуумный. Каплеуловитель. Стеклянные банки с притертыми крышками, вместимостью 500, 1000 см³. Воронки делительные вместимостью 500—1000 мл типа ВД-1000—29/32, ВД-500—29/32. Стакан химический на 50 и 100 мл. Пипетки автоматические на 1 — 10 мл. Палочка из химико-лабораторного стекла. Вата медицинская гигроскопическая, обезжиренная гексаном. Бумага фильтровальная лабораторная. Обратный холодильник Либиха на шлифах длиной 40 см. Воронки Шотта с пористым фильтром № 1 и № 3. Колонки хроматографические стеклянные длиной 500 мм и диаметром 10—15 мм с нижним пористым фильтром N 3.

Жидкостной хроматограф с УФ и флуоресцентным детектором типа Biotronic HPLC Eppendorf-Biotronic (Германия) с колонкой ODS-5 мкм, 150 х 4 мм. Спектрофотометр флуоресцентный типа MPF-43A. Лампа УФ с длиной волны 370 нм.

Микрошприц для ввода 1 — 100 мкл пробы заколом через клапан хроматографа. Устройство для фильтрования с фильтром 0,45 мкм.

Баллон стальной для сжатого гелия, номинальное давление 150 ат с редуктором и осушающими насадками с силикагелем.

РЕАКТИВЫ

Калия гидроксид, хч, экстрагированный очищенным гексаном. Натрия сульфат безводный, хч, экстрагированный гексаном и просушенный при 450 °C в течение 5 ч. Кислота серная, плотностью 1,84 г/см³ и 1% раствор. Гексан ч, очищенный концентрированной серной кислотой, отмытый дистиллированной водой, высушенный кристаллическим гидроксидом калия и перегнанный с дефлегматором или хч. Хлороформ хч, перегнанный. Спирт этиловый ректификованный технический. Дистиллированная вода HPLC. Бензол хч. Уксусный ангидрид чда. Ацетонитрил осч для HPLC. Сефадекс типа LH20 «Pharmacia» (Швеция). Диметилформамид чда. Целлюлоза микрокристаллическая ацетилированная «Aldrich» (США) или «Chemapol» (Чехия). Индикаторная бумага pH.

Стандарты: пирен, бенз(а)антрацен, хризен, бенз(к)флуорантен, бенз(Ь)флуорантен, бенз(а)пирен, бенз(е)пирен, дибенз(а, ^антрацен, бенз(Ь)хризен «Serva» (Германия).

Допускается применение других средств измерений, аппаратуры и реактивов, характеристики которых не уступают характеристикам указанных выше средств измерений, аппаратуры и реактивов.

ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ

Органические растворители подвергают перегонке. Диметил-формамид смешивают с 30 мл бензола и 12 мл воды на 250 мл растворителя и собирают фракцию с температурой кипения 153 °C. Для хроматографии ВЭЖХ растворители подвергают фильтрации через фильтр 0,45 мкм.

Получение ацетилированной целлюлозы.

Микрокристаллическую целлюлозу марки «Chemapol» (Чехия) в количестве 50 г смешивают в колбе вместимостью 500 мл с раствором 150 мл бензола, 70 мл уксусного ангидрида и 0,3 мл концентрированной серной кислоты, смесь перемешивают при 20 °C в течение 24 ч, жидкость сливают, а осадок заливают 200 мл этанола и выдерживают при той же температуре в течение 24 ч. Полученный осадок продукта отделяют на воронке Бюхнера, промывают 100 мл этанола, дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (200 мл воды) и сушат на воздухе.

ПЛАСТИНКИ С АЦЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗОЙ

5 г ацетилированной целлюлозы суспензируют в 20 мл этанола и ровным слоем выливают на поверхность стеклянной пластинки, которую высушивают на воздухе.

ПОДГОТОВКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ КАМЕРЫ

В хроматографическую камеру за 2 ч до начала хроматографирования заливают смесь растворителей для насыщения ее парами. Объем растворителя в камере должен находиться на высоте не более чем 0,5 см от уровня дна. Для лучшего насыщения дно и боковые стенки камеры покрывают фильтровальной бумагой.

СЕФАДЕКС

10 г Сефадекса ГН20 заливают 50 мл этанола и оставляют набухать в течение 4 ч. Набухший сорбент переносят в колонку, оставляя над слоем сорбента слой этанола во избежание пересыхания сефадекса.

ЭТАЛОННЫЕ РАСТВОРЫ

Исходные растворы полициклических ароматических углеводородов готовят растворением навески 20 мг вещества в бензоле в объеме мерной колбы на 100 мл.

Для ВЭЖХ готовят соответствующим разбавлением исходных бензольных растворов полициклических ароматических углеводородов в ацетонитриле до концентрации (мкг/мл): пирен — 10, бенз(а)антра-цен — 10, хризен — 20, бенз(к)флу-орантен — 1, бенз(Ь)флуорантен — 1, бенз(е)пирен — 10, бенз(а)пирен — 1, дибенз(а, 11)антрацен — 2.

Концентрация раствора внутреннего стандарта для ВЭЖХ бенз(Ь) хризена — 0,1 мкг/мл бензола.

Концентрация раствора сравнения для флуориметрии — 20 нг/мл бензола.

ПРОВЕДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ГИДРОЛИЗ И ЭКСТРАКЦИЯ

50 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу вместимостью 1000 мл, добавляют 20 г КОН и 250 мл этилового спирта, а также вносят внутренний стандарт в количестве 100 мкл 0,1 мкг/мл раствора в бензоле бенз(Ь)хризена. Колбу кипятят с обратным холодильником, перемешивая содержимое, в течение 3 ч.

Раствор отделяют от осадка на фильтре, промывают осадок горячим этанолом (50 мл), смешивают с 350 мл дистиллированной воды при 20 °С и экстрагируют 3 раза по 150 мл гексана, добавляя для расслоения в смесь по 1 г сульфата натрия. Экстракты объединяют, промывают водой (3 х 50 мл) и фильтруют через слой безводного сульфата натрия на воронке с пористой перегородкой. Полученный раствор в гексане упаривают до объема 100 мл.

Упаренный раствор смешивают в делительной воронке с 100 мл смеси диметилформамид — вода (9:1) в течение 1 мин, нижний слой переносят в плоскодонную колбу, верхний слой подвергают повторному экстрагированию 10 мл смеси диметилформамид — вода (9:1). Гексановый верхний слой отбрасывают. Нижние объединенные слои смешивают с 200 мл воды и экстрагируют гексаном (3 х 75 мл). Объединенные гексановые слои промывают водой (4 х 50 мл) и обезвоживают, выдерживая над безводным №₂8()₄ (30 г) в течение 1 ч.

Экстракт упаривают на роторном испарителе досуха в токе инертного газа и растворяют в 1 мл этанола.

ОЧИСТКА ЭКСТРАКТА НА СЕФАДЕКСЕ

1 мл спиртового раствора количественно переносят на колонку 15 х 500 мм с подготовленным сефадексом Ш20, осторожно сливают с колонки растворитель до верхнего края геля, давая растворителю полностью впитаться в слой сорбента и элюируют вещество с колонки этанолом, со скоростью 0,5 мл/мин, обеспечивая поток поддувом сжатого газа на колонку через силикагелевый патрон. Первую фракцию в количестве 50 мл отбрасывают, а вторую фракцию в количестве 100 мл собирают в колбу и упаривают на роторном испарителе досуха в токе инертного газа.

Остаток для проведения тонкослойной хроматографии растворяют в 1 мл бензола.

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕНЗ(А)ПИРЕНА

ИЗ ФРАКЦИИ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Полученный раствор сплошной полосой с шириной 0,5 см наносят на хроматографическую пластинку. На расстоянии 2 см от нее на том же уровне наносят касанием микропипетки точку 2 мкл раствора 1 мкг/мл бенз(а)пирена.

Пластинку помещают в хроматографическую камеру, насыщенную парами растворителя и проводят хроматографирование в смеси этанол-ацетон-вода (60:25:15). По достижении фронтом растворителя расстояния в 2 см от верхнего края пластины, ее вынимают и проявляют зону бенз(а)пирена на боковом поле (нанесение 2 мкл стандарта) в УФ свете. К, бенз(а)пирена в данной системе растворителей составляет 0,1. Определив точное месторасположение бенз(а)пирена из основного раствора, нанесенного на пластинку полосой, сорбент из зоны основного поля пластинки, соответствующей бенз(а)пирену, собирают на воронку Шотта, элюируют бензолом (5x5 мл) в круглодонную колбу и упаривают на роторном испарителе досуха в токе инертного газа.

Для спектрофлуориметрического анализа остаток растворяют в 1 мл бензола.

Для анализа методом ТСХ остаток растворяют в 200 мкл бензола.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ВЭЖХ

Сухой остаток, полученный после упаривания основной спиртовой фракции с колонки с сефадексом растворяют в 300 мкл ацетонитрила и в количестве 20 мкл вводят в подготовленный в соответствии

с техническим описанием жидкостной хроматограф с флуоресцентным детектором.

В автоматическом режиме записывают хроматограмму при длине волны возбуждения 300 нм и эмисионной длиной волны 418 нм. Элюент ацетонитрил-вода (8:2), поток 2 мл/мин.

Для хроматографа «АИех-334» с флуоресцентным детектором «Кга1озР8-970» и колонкой 4,6 х 150 мм Зпрекоэй ЬС-РАН 5 мкм время удерживания бенз(а)пирена — 5 мин, бенз(Ь)хризена — 13 мин.

РАСЧЕТ

Расчет содержания компонентов смеси в образце X (мкг/кг) проводят по формуле:

Х=М 8₁К-1000/8, - О,

где М — количество введенного внутреннего стандарта, мкг; 8, и 8₂ — площади пиков определяемого компонента и внутреннего стандарта; С — навеска образца, г; К — калибровочный коэффициент, определяемый экспериментально. Для указанных условий определения К составляет: бенз(Ь) хризен — 1, пирен — 119, бенз(а)антрацен — 101, хризен — 274, бенз(е) пирен — 107, бенз(к)флуорантен — 10, бенз(Ь)флуорантен — 12, бенз(а) пирен — 8, дибенз(а, Ь)антрацен — 17.

За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое результатов (X) двух параллельных определений, расхождение между которыми не должно превышать 40% по отношению к среднему арифметическому при р = 0,95.

Пределы возможных значений систематической составляющей погрешности измерений содержания углеводородов любой пробы при допускаемых методом изменениях влияющих факторов ± 0,2Х.

Минимально обнаруживаемая концентрация бенз(а)пирена в хроматографируемой пробе составляет 0,2 мкг/кг.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

СПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЕЙ

Анализируют фракцию бенз(а)пирена в 1 мл бензола, полученную после выделения методом тонкослойной хроматографии. Записывают спектр флуоресценции раствора при длине волны возбуждения 386 нм в диапазоне от 400 до 450 нм. Измеряют интенсивность флуоресценции при 406 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор бенз(а)пирена в бензоле с концентрацией 50 нг/мл, проведенный через все стадии выделения («холостой опыт» с добавкой 50 нг бенз(а) пирена). Спектры записывают в одинаковых условиях, проводя при необходимости соответствующее разбавление.

Для подтверждения чистоты выделенной фракции бенз(а)пирена записывают также спектры возбуждения при длине волны эмиссионного света 406 нм в диапазоне 280—390 нм.

Расчет содержания компонентов смеси в образце X (мкг/кг) проводят по формуле:

Х = СУ| ? V- 1000/У₂-С,

где С — концентрация раствора стандарта, мкг/мл; У[ и У₂ — интенсивность флуоресценции растворов образца (1) и стандарта (2); С — навеска образца, г; V — объем пробы, мл.

Пределы возможных значений систематической составляющей погрешности измерений содержания определяемых веществ любой пробы при допускаемых методом изменениях влияющих факторов ± 0,2Х.

Минимально обнаруживаемая концентрация бенз(а)пирена в хроматографируемой пробе составляет 0,2 мкг/кг.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕНЗ(А)ПИРЕНА МЕТОДОМ ТСХ

Анализируют фракцию бенз(а)пирена в 200 мкл бензола, полученную после выделения методом тонкослойной хроматографии.

На хроматографическую пластинку с интервалом в 2 см наносят микрошприцем по 10 и 20 мкл раствора образца, а также 2,5 и 5 мкл раствора стандарта с концентрацией бенз(а)пирена 1 мкг/мл.

Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии и проводят хроматографирование в смеси этанол-ацетон-вода (60:25:15), давая подняться растворителю на 10 см.

Пластинку высушивают и подвергают УФ-облучению с максимумом эмиссии 365 нм.

Сравнивают интенсивность флуоресценции пятен образца и стандарта. В данных условиях возможно определение содержания бенз(а) пирена не менее 2,5—5 нг в одном пятне, что соответствует его концентрации 0,5—1 мкг/кг массы образца. При более высоком содержании бенз(а)пирена проводят разведение раствора и в результате хроматографирования устанавливают границу между отсутствием флуоресценции пятна и его устойчивым свечением, соответствующим 2,5—5 нг бенз(а)пирена в одном пятне.

Расчет содержания бенз(а)пирена в образце X (нг/кг) проводят по формуле:

Х= 2,5 ? У-1000/У-О,

где 2,5 — нижняя граница определения бенз(а)пирена в пятне (2,5 мкл раствора сравнения с концентрацией 1 мкг/мл); У — объем раствора образца, мкл; V — объем раствора нанесенной пробы, мкл; С — навеска образца, г.

За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое результатов (X) двух параллельных определений, расхождение между которыми не должно превышать 60% по отношению к среднему арифметическому при р = 0,95.

Минимальная концентрация бенз(а)пирена, определяемая данным методом, составляет 0,5 мкг/кг.