Особые нуклеотиды

Кроме рассмотренных нами нуклеозидфосфатов с одним остатком фосфорной кислоты (они часто так и называются - нуклеозидмонофосфаты) в клетках содержатся нуклеозидди- и нуклеозидтри- и нуклеозидциклофосфаты. На рис. 2.13 слева показана структура молекулы аденозин 5'-трифосфорной кислоты - АТФ (АТР). Три остатка фосфорной кислоты соединены с помощью высокоэнергетических пирофосфатных связей. При гидролизе этой связи освобождается от 30 до 50 кДж/моль энергии, в то время как при гидролизе обычной сложноэфирной фосфатной связи освобождается энергия, равная 8-12 кДж/моль. Таким образом, молекулы АТР, а также гуанозинтрифосфата (GTP) играют важную роль «поставщиков энергии» для обеспечения множества биохимических процессов, протекающих в клетке.

Структуры молекулы 5'АТР (слева) и 5'3'-сАМР (справа)

Рис. 2.13. Структуры молекулы 5'АТР (слева) и 5'3'-сАМР (справа)

Из четырех рибонуклеозидтрифосфатов (общее обозначение NTP, где N = A, G, U или С) синтезируются все виды РНК. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) являются «строительными кирпичиками», из которых ферментативно синтезируются полимерные молекулы ДНК в процессе ее репликации.

Особую роль в клетке играют нуклеозидциклофосфаты - нуклеотиды, в которых остаток фосфорной кислоты образует внутримолекулярный диэфир одновременно с 3'- и 5'-гидроксильными группами (рис. 2.13, справа). Как правило, в виде таких циклофосфатов существуют цикло-АМФ (сАМР) и цикло-ГМФ (cGMP). Эти нуклеотиды образуются из соответствующих нуклеозидтрифосфатов под действием ферментов аденилатциклазы и гуанилатциклазы. В биологических процессах они выступают в качестве промежуточного посредника регуляторного действия гормонов.

Определение первичной структуры ДНК

Первичная структура ДНК, т. е. состав и порядок следования нуклеотидов в этой полимерной молекуле, определяет состав и последовательность аминокислот в белке, которые она кодирует. Поэтому определение последовательности ДНК - секвенирование (от англ, sequence - последовательность) - является важной задачей биоорганиче-ской химии. Для секвенирования ДНК на сегодня разработаны различные способы, ряд биотехнологических фирм выпускает секвенирующие установки, позволяющие проводить эту работу с огромной скоростью.

Эти технологические достижения позволили определить последовательности не только коротких ДНК, но и целых геномов, вплоть до генома человека. В рамках нашего курса будут рассмотрены два способа секвенирования - химический и химико-ферментативный.

Химический способ секвенирования используют для прочтения коротких одноцепочечных олигонуклеотидов. Принцип метода заключается в проведении гидролиза олигонуклеотида различными специфичными химическими реагентами и последующего анализа полученных фрагментов с помощью электрофореза. На рис. 2.14 приведен простой пример секвенирования октануклеотида GTCAGACT. На первом этапе производят мечение олигонуклеотида введением радиоактивного остатка фосфорной кислоты по 5'-концу. Далее образец делят на 4 порции и в каждую пробирку добавляют разные химические реагенты. Рассмотрим химические реакции в каждой из пробирок:

  • 1. Действием диметилсульфата молекула расщепляется по гуанозиновым звеньям. Таким образом, в этой пробирке окажутся 4 фрагмента, но только два из них будут радиоактивно меченными (т. е. содержащими радиоактивный фосфат на 5'-конце) - pG и pGTCAG.
  • 2. Действием муравьиной кислоты в другой пробирке эта же молекула расщепляется по всем пуриновым основаниям на 8 фрагментов, но радиоактивными будут только 4 из них - pG, pGTCA, pGTCAG и pGTCAGA.
  • 3. Действием гидразина в третьей пробирке олигонуклеотид расщепляется по всем пиримидиновым основаниям на 8 фрагментов, но радиоактивными будут только 4 из них - pGT , pGTC, pGTCAGAC и pGTCAGACT.
  • 4. В 4-й пробирке действием гидразина в присутствии соли NaCl олигонуклеотид расщепляется только по цитидинам. При этом образуется 4 фрагмента, но радиоактивными будут только 2 - pGTC и pGTCAGAC. На следующем этапе все четыре реакционных смеси наносят в лунки геля и проводят электрофорез. Полосы фрагментов с радиоактивной меткой проявляют с помощью фотобумаги.

Сборку молекулы проводят с самого короткого фрагмента (того, что имеет самый большой пробег на картинке фореза). В нашем случае это pG в первой лунке и pG во второй. В случае такого совпадения в последовательности указывается нуклеотид из первой лунки, где прово32pGTCAGACT

4

NH.NH,, NaCI

  • 2
  • 2)
  • 3)
  • (CH)3S°4/ I

/ нсоон

nh2nh

Расщепление по

G+A Т+С С

G

Принцип химического секвенирования

Рис. 2.14. Принцип химического секвенирования (по Максаму-Гилберту) на примере октануклеотида. Кружками обозначено наличие радиоактивной метки на фрагменте дилось расщепление только по одному из оснований. Следующая полоса - это фрагмент из 3-й пробирки, и он соответствует двойке pGT, т. е. в нашей последовательности следующая буква - Т. Далее на форезной картинке мы видим две полоски с одинаковым пробегом - в лунках 3 и 4. Это тринуклеотиды pGTC (они есть в обеих пробирках - см. выше), оба заканчиваются на С, т. е. в нашей последовательности следующая буква - С. И так далее. Таким образом, прочтение последовательности происходит при продвижении по полосам на этой картинке снизу вверх, как по лесенке, и в результате восстанавливают всю последовательность исходного олигонуклеотида.

Этот способ секвенирования был разработан в 1977 г. А. Макса-мом и У. Гилбертом и назван их именем (Махат-бШе/7 method). За исследования в этой области в 1980 г. они были удостоены Нобелевской премии по химии совместно с Ф. Сенгером и П. Бергом.

В основе ферментативного способа секвенирования ДНК лежит способность фермента ДНК-полимеразы синтезировать новую цепь нуклеотида, соответствующую (комплементарную) материнской цепи.

ДНК-полимераза 1 (Poll, 928 а.к.) является ключевым ферментом при репликации ДНК. Этот фермент, «двигаясь» по одноцепочечной молекуле ДНК, катализирует образование фосфодиэфирных связей, между 3'-гидроксилом предыдущего нуклеозида и 5'-фосфатной группой следующего (рис. 2.15). То есть рост новой цепи, комплементарной материнской, происходит в направлении от 5' к 3'-концу. В качестве «строительного материала» используются 5'-нуклеозидтрифосфаты TTP, ATP, GTP и СТР. Скорость синтеза комплементарного полимера велика, например, у прокариот она составляет 1 000 н.о. в секунду. Открытие этого фермента принадлежит американскому биохимику Артуру Корнбергу, за которое он получил Нобелевскую премию 1959 г. ДНК-полимераза 1 используется как ключевой элемент полимеразной цепной реакции (ПЦР), применяемой в генетической инженерии и молекулярном анализе, когда необходимо получить определенный фрагмент ДНК в больших количествах - ам-плифицироватъ, т. е. размножить его. Схема этой реакции приведена на рис. 2.16. В пробирку вносят: а) молекулу ДНК, фрагмент которой надо размножить (она называется матрицей); б) 2 праймера - олигонуклеотиды длиной 20-25 н.о., комплементарные крайним участкам цепей ДНК, которые будет размножены; в) набор 5'-нуклеозидтрифосфатов (NTP)

Нуклеозидтрифосфат

Схема реакции, катализируемой ДНК-полимеразой

Рис. 2.15. Схема реакции, катализируемой ДНК-полимеразой

со со и г) фермент Poll. Праймеры необходимы, поскольку полимераза не работает с «пустого» места, она катализируетреакцию конденсации между 3'-гидроксилом предыдущего нуклеотида, который является последним в сдвоенной материнской цепи с 5'-фосфатной группой последующего нуклеотида, комплементарного первому нуклеотиду одноцепочечной матрицы. Вначале сдвоенную молекулу ДНК денатурируют плавлением при повышенной температуре (на рис. 2.16 это 94°С). Затем температуру реакционной смеси понижают (на рис. 2.16 - до 52°С). При этом с З'-кон-цов каждой одноцепочки присоединяются соответствующие праймеры.

  • 3'
  • 5-

Целевая последовательность

_ I .............. I II И II ....... _ д,

| Денатурация, 94 °С

  • 5’---------3’
  • 3’ 5’

Отжиг праймеров, 52 °С

Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Рис. 2.16. Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Этот процесс называется «отжиг праймеров». ДНК-полимераза синтезирует на каждой материнской цепи комплементарную дочернюю, удлин-няя праймеры в направлении 5’—>3*. Далее полученные 2 двойные молекулы вновь плавят, отжигают праймеры, и затем они «прирастают» уже на 4 копиях. И так далее. С каждым циклом в смеси количество копий увеличивается в 2" раз, где п — количество циклов реакции.

Используемая в ПЦР полимераза должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, что для обычных белков не характерно. Настоящим подарком для молекулярных биологов стала полимераза, выделенная из термофильных батерий Thermus aquaticus (Taq-полимераза), обитающих в горячих источниках (данный фермент упоминался ранее в гл. 1). В отличие от обычных ферментов, температурный оптимум которых находится в диапазоне 35-40 °С, Тод-полимераза сохраняет свою функциональную активность при температуре около 100 °С.

Ф. Сенгер разработал способ секвенирования ДНК на основе ПЦР, за что в 1980 г. был удостоен Нобелевской премии повторно (первую он получил за установление структуры молекулы инсулина в 1958 г.). Этот способ секвенирования назвали его именем - «секвенирование по Сенгеру». Другие названия этого метода - метод обрыва цепи или метод дидезокситерминаторов. Обрыв цепи, или терминация, происходит в ходе ПЦР, когда в дочернюю цепь включается нуклеозидтрифосфат без З'-гидроксильной группы - Эмдезоксирибонуклеозидтрифосфат ddNTP. Принцип секвенирования по Сенгеру приведен на рис. 2.17. В реакционную смесь вносят все необходимые компоненты ПЦР. Затем делят ее на 4 части и в каждую дополнительно вносят один из дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Каждый раз, когда при синтезе межнуклеотидной связи в цепь включается такой остаток, реакция останавливается - следующее звено не может присоединиться, поскольку З'-ОН отсутствует. Таким образом, в пробирке с ddATP накапливаются олигонуклеотиды разной длины, каждый из которых оканчивается на аденозин, в пробирке с ddCTP - на цитидин, в пробирке с ddGTP - на гуанозин, а с ddTTP - на тимидин. Далее реакционные смеси анализируют с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях. В зависимости от размера олигонуклеотиды-продукты ПЦР двигаются в геле с разной скоростью. Полученную картинку проявляют радиоавтографией. Для этого продукты метят изотопной меткой, используя в реакционной смеси добавку радиоактивно-меченного 32Р АТР.

Реакционная смесь содержит:

Анализируемая ДНК: 3’-AACAGCTAGAGTCACTGGAT-5'

Праймер: 5'-TTGTCG-3’ 5'-нуклеозидтрифосфаты: ATP, GTP, СТР, ТТР

Фермент: ДНК-полимераза

Метка: 32РАТР

1)+ddATP 2)+ddGTP 3)+ddCTP 4)+ddTTP

Принцип секвенирования по Сенгеру

Рис. 2.17. Принцип секвенирования по Сенгеру

Полученное изображение читают снизу вверх по полоскам, начиная от полосы самого маленького молекулярного веса (см. рис. 2.17). нетрудно видеть, что прочитанная таким образом последовательность является комплементарной исходной матрице.

В настоящее время секвенирование проводят в автоматическом режиме, а для анализа используют флуоресцентные метки, которые присоединяют к молекулам дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Каждая флуоресцентная метка имеет свой спектр свечения (окраску). Для электрофореза используют капилляры, заполненные гелем. Свечение инициируется лазерным лучом и по цвету соотносится с соответствующим основанием. Пример получаемой при этом картинки приведен на рис. 2.18. Каждая буква отражается в виде пика со своим цветом.

Фрагмент гена рецептора MC1R

Рис. 2.18. Фрагмент гена рецептора MC1R

На рисунке приведен пример образца имеющего гетерозиготный генотип, когда в аллелях на одном и том же месте находятся разные нуклеотиды С и Т (показано стрелкой). Такая мутация называется однонуклеотидным полиморфизмом. Таким образом, секвенирование позволяет выявлять в том числе и наличие мутаций.

Г ГЦ]

?иав Центр коллективного пользования "Геномика" СО РАН (Новосибирск) обладает широкими возможностями как для высокопроизводительного параллельного секвенирования (Next Generation Sequencing) геномов, митогеномов или отдельных локусов, так и для классического секвенирования ДНК по Сенгеру. Так, автоматический генный анализатор ABI3130XL производства фирмы Applied Biosystems (США) способен достоверно определять последовательности ДНК длиной до 1 000 нуклеотидов (рис. 2.19). Показаны 96-луночные планшеты с образцами для анализа.

Прибор одновременно анализирует 16 образцов, разделяя продукты реакции Сенгера в капиллярах диаметром около 50 мкм и длиной до 80 см, заполненных полимером (модифицированным линейным полиакриламидом). Идентификация конкретного нуклеотида на определенной позиции секвенируемой последовательности ДНК происходит благодаря флуоресценции включенных в продукты реакции Сенгера и связанных с соответствующими дидезоксирибонуклеозидтрифосфатами меток BigDye, облучаемых лазером при прохождении фрагмента ДНК через кварцевый участок капилляра.

Материал любезно предоставлен к.х.н. А. А. Бондарем, ИХБиФМ, Новосибирск

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >