Лабораторная работа № 13. Получение чистых культур микроорганизмов

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель работы: приобрести опыт по выделению чистой культуры микроорганизмов.

Материалы и оборудование: пробирки с бактериальной культурой, бактериологические петли, стерильные пастеровские пипетки, чашки Петри, шпатель Дригальского, карандаши по стеклу, питательные среды в пробирках.

Теоретические сведения

В биотехнологических производствах в качестве одного из видов исходных материалов используют чистую культуру микроорганизмов. Чистой культурой (ЧК) называют популяцию, представляющую собой потомство одной или нескольких клеток одного вида микроорганизмов. В генетических исследованиях пользуются клонами - чистыми культурами, полученными от одной споры или гаплоидной клетки. В естественных условиях различные объекты содержат, как правило, смешанную микрофлору. Для диагностических исследований с целью выяснения возбудителей порчи продуктов или их обсемененности микроорганизмами требуется выделение чистой культуры.

Методы выделения ЧК (прямые и косвенные). Прямые - основаны на выделении под непосредственным контролем через микроскоп, например, метод Линднера. Известны методы извлечения одной клетки из взвеси микроорганизмов с помощью специальных приборов (микроманипулятор, микроселектор Перфильева) под контролем микроскопа. Однако наиболее распространенным способом выделения чистых культур являются косвенные методы выделения чистой культуры микроорганизмов, основанные на изоляции одной микробной клетки от массы микроорганизмов и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов. Для посева чаще используются агаризованные среды в чашках Петри. Этот метод предложен известным немецким микробиологом Кохом и носит название метода пластинчатых (или чашечных) культур Коха. Основной задачей метода является разведение концентрации микроорганизмов в исследуемом материале с таким расчетом, чтобы при посеве его на питательной среде выросли изолированные колонии. Существуют два основных метода разведения исследуемого материала: 1) на поверхности плотной питательной среды «методом истощающего посева»; 2) предварительное разведение материала в физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде в пробирках и высев готового разведения на плотную питательную среду.

Метод истощающего посева на поверхности плотной среды. Этот метод используется для выделения чистых культур аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов. С этой целью для посева берут ряд чашек Петри с плотной средой; в первую чашку наносят исследуемый материал и распределяют его по поверхности шпателем Дригальского или бактериологической петлей. Затем, не стерилизуя шпатель (или петлю), производят посев последовательно на поверхность среды в остальных чашках (рисунок). Количество материала, внесенного в среду, при этом последовательно убывает (истощающий посев).

Метод предварительного разведения исследуемого материала в стерильной водопроводной воде (или физиологическом растворе). Используется для выделения чистых культур микроорганизмов, как аэробных, так и анаэробных. Готовят разведения материала в 10-100 раз и более (в зависимости от предполагаемой обсемененности микроорганизмами) и производят посев разведений, пользуясь поверхностным или глубинным методом. Выделение чистых культур строгих анаэробов по методу Коха требует условий выращивания без доступа кислорода. Если разведение исследуемого материала выполнено правильно, на поверхности среды или в ее толще (в зависимости от метода посева) образуются изолированные колонии микроорганизмов, видимые невооруженным глазом.

Каждая колония состоит из клеток одного вида, однако для выделения чистой культуры необходимо пересеять колонию на отдельную среду, т. е. изолировать ее от микроорганизмов других видов.

Рассев микроорганизмов на поверхность плотной среды

Рисунок. Рассев микроорганизмов на поверхность плотной среды: а - шпатель Дригальского; б - рассев шпателем; в - рост микроорганизмов после рассева шпателем; г - рост микроорганизмов после рассева петлей

Завершающий этап выделения чистой культуры микроорганизмов неизвестного вида - это проверка чистоты культуры на изолированной среде визуально (просмотр посева невооруженным глазом) и микроскопией мазка. Видовое название чистых культур большинства микроорганизмов устанавливают путем изучения морфологических, культуральных и физиологических свойств. Для идентификации плесневых грибов достаточно изучить морфологические и культуральные свойства. По совокупности изученных признаков определяют таксономическое положение (положение в систематике) микроорганизмов, пользуясь специальными определителями. Морфологические свойства исследуют при микроскопии прижизненных или фиксированных окрашенных препаратов. Морфологическая характеристика микроорганизма должна включать форму клеток, их сочетание и размеры, подвижность, способность к образованию спор, наличие включений. При описании морфологии следует указывать возраст культуры, состав среды, условия культивирования. Культуральные свойства микроорганизмов устанавливают по особенностям роста на питательных средах. На жидких питательных средах отмечают характер распределения культуры - равномерное, вызывающее помутнение среды, придонное или поверхностное, что обусловлено отношением микроорганизмов к кислороду воздуха. Мутность среды может быть хлопьевидной, однородной. Пленка - тонкой, плотной и рыхлой, гладкой, морщинистой или складчатой. Осадок - скудным или обильным (количество); плотным, рыхлым, слизистым (консистенция). На плотных питательных средах исследуют характер колоний. Поскольку колония образуется в результате размножения одной клетки, то ее строение зависит от особенностей деления клеток данного вида микроорганизмов. Наиболее типично видовые признаки выражены у поверхностных колоний:

  • - форму, профиль, блеск и цвет отмечают визуально;
  • - край и структуру - при малом увеличении микроскопа;
  • - консистенцию (мягкая, слизистая, тягучая или хрупкая) определяют прикосновением к ее поверхности петлей;
  • - размеры - обычной линейкой или окулярным микрометром при малом увеличении микроскопа (колонии точечные - менее 1 мм в диаметре, мелкие - 1-2, крупные - более 4 мм). Физиологические свойства микроорганизмов обусловлены ферментативной активностью и, следовательно, выражают особенности обмена веществ клетки. Это важный дифференциальный признак, который используется при идентификации бактериальных и дрожжевых видов.

Распространенным методом изучения физиологических свойств микроорганизмов является выращивание их на дифференциально-диагностических средах, позволяющих определить биохимическую активность микроорганизмов в отношении веществ, введенных в среду. Отношение к кислороду (тип дыхания) определяется по характеру роста в столбике агара (МПА) при посеве уколом. После инкубации в термостате в течение 48 ч при температуре 30-38 °С возможны три типа роста в зависимости от типа дыхания:

  • - шляпкой на поверхности (аэробные микроорганизмы);
  • - у дна пробирки (анаэробные микроорганизмы);

- равномерный по всей длине укола (факультативно анаэробные микроорганизмы).

Протеолитические свойства определяют по выделению из питательной среды газов - продуктов расщепления белка. Для этой цели культуру выращивают на МПБ или мясной воде, закрепив в пробирке полоску фильтровальной бумажки, пропитанную реактивом, реагирующим на наличие определенного газа. Так, выделение аммиака обнаруживают по синему цвету лакмусовой бумажки, сероводорода - с помощью фильтровальной бумаги, пропитанной уксуснокислым свинцом (бумага чернеет в результате образования сернистого свинца), индола - с помощью бумажки, пропитанной щавелевой кислотой (покраснение в результате образования соединения с индолом).

О протеолитических свойствах микробов судят также по способности разжижать желатин. При посеве уколом в столбик желатина через 2 ч культивирования отмечают наличие и характер разжижения - послойное, воронкообразное, пузырчатое. Сахаролитические свойства определяют на МПБ, 1 %-ном растворе пептонной воды и др., содержащих тот или иной углевод и индикатор. Расщепление углеводов под влиянием микробов сопровождается изменением цвета индикатора в результате подкисления среды, а на жидких средах в ряде случаев и газообразованием, которое улавливают с помощью стеклянного «поплавка». Образовавшийся газ вытесняет среду и обнаруживается в поплавке в виде пузырька. Характер свертывания лакмусового молока является важным биохимическим признаком. При посеве на лакмусовое молоко отмечают изменения pH и характер сгустка. В зависимости от того на какую составную часть молока действуют ферменты изучаемого микроорганизма, различают следующие изменения в молоке: а) кислотное свертывание - действие фермента на лактозу - сопровождается образованием плотного сгустка и повышением кислотности; цвет молока изменяется от сиреневого к красному; б) пептонизация - действие протеолитических ферментов на белки молока - сопровождается образованием мутной желтоватой жидкости, среда становится щелочной из-за выделения аммиака и молоко синеет. Способность расти на картофеле выявляют при посеве микроорганизмов на скошенный стерильный ломтик картофеля. При этом отмечают дополнительный культуральный признак, а также амилолитическую способность культуры по пробе с йодом. Посинение среды после нанесения капли раствора Люголя в зоне роста микроорганизмов указывает на наличие у них фермента амилазы. Следует подчеркнуть, что перечень исследуемых признаков, как и методы культивирования, дифференцируется в зависимости от предполагаемого вида микроорганизмов.

Ход работы

Работа выполняется в два этапа. На первом студенты используют пищевые продукты, имеющие один или несколько пороков микробиального происхождения для выделения чистой культуры и визуального изучения. Второй этап работы осуществляется на следующем занятии.

Занятие 1. В лабораторном журнале указывают исходные данные исследуемого объекта (таблица). [1] [2] [3] [4]

Таблица

Характеристика исследуемого объекта

Наименование

объекта

Органолептические показатели продукта

Характеристики микробиологического порока

Цвет

Запах

Консистенция

Внешний вид

Цвет

Взять каждому студенту для посева по две чашки Петри с мясопептонным агаром (для бактерий) или сусло-агаром (для дрожжей и микомицетов).

Надписать их по торцу крышки, указав дату, номер чашки, инициалы, поставить на стол крышками вверх.

С помощью профламбированной бактериологической петли взять небольшое количество изучаемого материала и внести в пробирку с 4 см стерильной воды и хорошо перемешать.

Одну каплю такой взвеси с помощью петли или стерильной пипетки нанести на поверхность агара первой чашки. Стерильным шпателем Дригальского аккуратно и тщательно распределить по всей поверхности среды. Этим же шпателем (не фламби- руя его) проводят по поверхности второй, при необходимости третьей чашки. По окончании посева шпатель погружают в дезинфицирующий раствор.

Чашки переворачивают вверх дном, чтобы накапливающаяся конденсационная вода при застывании среды и росте культуры не стекала с крышки и не размывала рост. Ставят подготовленные посевы в термостат, чашки с МПА при температуре 37 °С, с сусло-агаром при - 32 °С.

Занятие 2.

1) Подсчитать количества колоний, выросших на чашках

Петри.

2) Описать их культуральные признаки, микросопического контроля чистоты культуры в колониях; изоляции чистой культуры на скошенный агар в пробирку.Для этого выполняют действия в следующей последовательности.

Визуально, не открывая крышки чашки Петри, описывают культуральные признаки колоний микроорганизмов преобладающего типа на плотных средах (МПА, СА): положение в среде (поверхностное или глубинное), форма колонии, размер колонии, профиль, блеск, цвет. Используя малое увеличение микроскопа, отмечают для колонии форму края, структуру. Для бактерий и дрожжей прикосновением к поверхности петли определяют консистенцию (мягкая, слизистая, тягучая, хрупкая).

Проводят микроскопирование колонии. Для этого из небольшой части колонии готовят фиксированный мазок и окрашивают его фуксином. Микроскопируют с использованием

1

иммерсионного объектива. Наличие однородных клеток свидетельствует о чистоте культуры. Микрографируют.

Пересеивают культуру изученной колонии на скошенный агар в пробирку. Соблюдая условия стерильности, отбирают бактериологической петлей часть микробной биомассы и сеят ее штрихом на поверхность скошенного агара. Операции по пересеву желательно выполнять вдвоем: один приоткрывает крышку чашки Петри; второй в это время вынимает пробку, отбирает петлей материал, распределяет его штрихом по поверхности среды и закрывает пробкой пробирку. Со стороны агара на стенке пробирки указывают дату посева, ФИО и номер группы.

  • 3) Оформить протокол занятий 1 и 2 в соответствии с нижеперечисленными пунктами.
  • 1. Название работы, дата выполнения. 2. Цель работы. 3. Определение терминов «чистая культура», «клон». 4. Наименование методов выделения чистой культуры прямым и косвенным способами. 5. Сущность методов выделения ЧК. 6. Перечислить операции по выделению чистой культуры методом Дригаль- ского. 7. Схема записи результатов первого занятия, микрография. 8. Перечень технических приемов, используемых для изучения культуральных и морфологических признаков выделенной культуры на втором занятии, микрографии. 9. Схема записи результатов второго занятия. 10. Заключение о видовой принадлежности.

Контрольные вопросы

  • 1. Что следует понимать под термином «чистая культура» ?
  • 2. Укажите назначение ЧК.
  • 3. На каких приемах основаны методы выделения ЧК?
  • 4. Чем отличаются методы выделения ЧК?
  • 5. Какие признаки устанавливают при идентификации ЧК?
  • 6. Какие питательные среды рекомендуют использовать для выделения ЧК?
  • 7. Какие виды микробиальных поражений характерны для сырья и готовых продуктов?

  • [1] Приготовить препарат «раздавленная капля» для дрожжевых и микроскопических грибов и «фиксированный мазок длябактерий».
  • [2] Провести микроскопирование, выполнить микрографиии описать морфологические признаки препаратов: формы клеток,их сочетание и размеры, способность к образованию спор, формуспороносцев.
  • [3] По окончании изучения необходимо классифицироватьвыявленные микроорганизмы по их принадлежности - микоми-цеты, дрожжи, бактерии.
  • [4] Выполнить операции по выделению чистой культурымикроорганизмов методом Дригальского. Техника выполнения посева по методу Дригальского.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >