Лабораторная работа № 11. Изучение кинетики гибели микроорганизмов

Цель работы: определить основные показатели, которые характеризуют эффективность термической стерилизации среды для обеспечения её асептики (100 %-ной гибели микроорганизмов).

Материалы и оборудование: суспензия дрожжей {Saccharomyces cerevisiae) в объеме 400 см3 на каждое занятие; микроскопы, камера Горяева-Тома, водяная баня (термостат), краситель (метиленовый синий); лабораторные стаканчики объемом 20-40 см3, пробирки (4 шт. на бригаду), мерные цилиндры объемом 10 мл (4 шт.), пипетки объемом 1 или 2 мл (4 шт.), фильтровальная бумага, марлевые салфетки.

Теоретические сведения

Гибель части клеток в процессе роста популяции учитывается большинством моделей как процесс, протекающий параллельно и независимо от размножения жизнеспособных особей той же культуры. В ряде случаев, а именно при стерилизации жидких и твердых сред, оборудования, вспомогательных материалов гибель части или всех клеток становится целью процесса.

Такая постановка задачи требует таких методов решения, которые способны гарантировать асептику среды и воспроизводить результаты в промышленных условиях при длительной эксплуатации установок.

Основным методом стерилизации жидкостей и аппаратуры в лабораторных условиях является термический, связанный с достаточно длительным прогревом до заданной температуры.

Гибель микроорганизмов при повышенной температуре происходит, как правило, со скоростью, пропорциональной числу клеток или спор, еще сохранивших жизнеспособность к данному (анализируемому) моменту времени:

Если в начальный момент времени при г = 0 число жизнеспособных особей микроорганизмов составляла [х0], то ко времени т она достигает величины:

откуда

где к - удельная скорость гибели, мин'1; In 0У[Х - критерий стерилизации.

Увеличение значения критерия стерилизации означает приближение к обеспечению асептических условий среды (процесса). Так, уменьшение числа клеток в 10 раз вследствие их гибели соответствует значению In [Х0]/[Х] критерия стерилизации, равному 2,303.

На практике важной характеристикой оказывается время, за которое концентрация выживших клеток уменьшается в 10 раз: г10=2,303/*.

Величина критерия стерилизации обычно задается при стерилизации жидких сред для обеспечения требуемой степени их асептики. Поэтому, зная значение удельной скорости гибели к клеток при определенной постоянной температуре, по уравнению (1) находят необходимую продолжительность термообработки среды г.

Гибель клеток и спор резко ускоряется с ростом температуры. В интервале 100-140 °С удельная скорость гибели клеток к возрастает в 104-104 раз, при повышении температуры на 10 °С удельная скорость гибели клеток и спор возрастает в 10 раз и более.

Зависимость удельной скорости гибели клеток от температуры описывается уравнением Аррениуса:

Постоянную Е в этом уравнении по аналогии с химической кинетикой называют энергией активации процесса гибели микроорганизмов.

Ход работы

1. Предварительно перемешав исходную суспензию микроорганизмов, разлить её в лабораторные стаканчики, откуда отобрать по 3-4 см3 в четыре пробирки.

Примечание: для подсчета исходного числа клеток использовать одну из пробирок (нулевая Х0 проба 0).

  • 2. Каждая бригада помещает три пробирки в три водяные термостатируемые бани с заданными температурами эксперимента (Г = 64, 84 и 100 °С).
  • 3. Через определенные промежутки времени (14 мин) отобрать из пробирок пробы микробных суспензий для подсчета числа клеток.
  • 4. Провести подсчет общего числа клеток в отобранных пробах с использованием счетных камер Горяева-Тома, а также числа живых клеток с предварительным окрашиванием проб микробных суспензий.
  • 5. Оценить эффективность обеспечения асептики жидкой среды вследствие её термообработки при различных температурах.

Вычислить х - общее число клеток, а также число живых клеток в 1 см3 суспензии и построить графическую зависимость х =/(г); анализируют кинетику гибели микробных клеток во временных интервалах от 0 до 30 минут и от 30 до 60 мин. Сделать вывод о влияния температуры и продолжительности термообработки на эффективность стерилизации среды. Вычислить значение критерия стерилизации ln[x0]/[jc].

  • 6. Определить удельную скорость гибели к микроорганизмов при заданной температуре (Г = 64, 84, 100 °С) по уравнению (2). Результаты экспериментальных данных и расчетов представить в виде таблицы.
  • 7. Рассчитать время, за которое концентрация выживших клеток снижается в 10 раз.

Таблица

Экспериментальные данные и показатели термической стерилизации

№ пробы

т, мин

a

X

1п[х0]/[х]

к, мин'1

0

0

1

14

2

30

3

44

4

60

8. Построить графическую зависимость (рисунок) в координатах Ink = f(/T) приводится в градусах Кельвина). Для построения зависимости использовать значения удельной скорости гибели к живых (неокрашенных) клеток в анализируемых пробах.

Зависимость к от 1/Т

Рисунок. Зависимость к от 1/Т

Из рисунка найти tga и точку пересечения с осью ординат. В линеаризованном виде уравнение Аррениуса может быть записано как

Здесь 1пА определяется из графика как величина, численно равная величине отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат, а E/R = tga. Таким образом, значение удельной скорости гибели определяется из уравнения Аррениуса с найденными константами: А и E/R.

Эффективность термообработки для обеспечения асептики жидких сред может быть оценена для любой температуры: так как А, Е, R - постоянные величины, подставив в уравнение Аррениуса (3) любое значение Т, рассчитывается к.

Контрольные вопросы

  • 1. Асептика, асептические условия, стерильность.
  • 2. Какое влияние оказывает посторонняя микрофлора на эффективность микробиологических производств? Приведите примеры.
  • 3. Каким образом обеспечивается достижение и поддержание асептических условий на стадии ферментации?
  • 4. Что такое термическая стерилизация?
  • 5. В чем заключается химическая стерилизация?
  • 6. Стерилизация ионизирующим излучением.
  • 7. Фильтрующая стерилизация.
  • 8. Проанализируйте существующие способы и режимы стерилизации. Какие пути повышения эффективности режимов стерилизации жидкостей вы знаете?
  • 9. Какие существуют методы и режимы получения стерильного воздуха?

Лабораторная работа № 12.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >