Лабораторный контроль гигиены производственных участков сырья и готовой продукции на предприятии

Производственная лаборатория в соответствии с утвержденным графиком проводит микробиологический контроль следующих объектов:

  • — поверхность стен различных помещений;
  • — поверхность оборудования и тары;
  • — воздушная среда в цехах;
  • — вода питьевая;
  • — вода сточного коллектора;
  • — смывы с рук и одежды рабочих отдельных цехов;
  • — сырье, вспомогательные материалы, специи;
  • — выпускаемая продукция (колбасы, консервы, копчености и др.).

Лаборатория, кроме этого, проверяет соблюдение требований санитарных правил для предприятий мясной (молочной, рыбной) промышленности. Согласно этим документам проводится контроль санитарного состояния отдельных участков предприятия.

Для поддержания надлежащего санитарного режима на мясокомбинате необходимо регулярно проводить тщательную обработку (мытье и дезинфекцию) оборудования, помещений и рук персонала. Для мытья и обезжиривания оборудования рекомендуются щелочные растворы, разрешенные органами санитарного надзора: 0,5 % раствор кальцинированной соды, жидкость «Прогресс», 1 % раствор тринатрийфосфата и др. Для дезинфекции пола, панелей и стен рекомендуется применять 1 % раствор хлорной извести, для оборудования — 0,2%, для рук 0,1 %. Исходный раствор хлорной извести готовится из расчета 100 г извести на 1 л воды, или 1 кг на 10 л, т. е. 10 % раствор. Его следует хранить в бутыли из темного стекла с плотно закрывающейся пробкой. Рабочие растворы готовятся из следующего расчета: для приготовления 1% раствора необходимо 1 л 10% хлорной извести растворить в ведре воды, для 0,2 % — 200 мл (стакан) на ведро, для 0,1 % — полстакана на ведро. При обследовании мясокомбината необходимо проверить умение персонала правильно провести дезинфекцию, приготовить необходимые растворы, соблюдение правил пользования туалетом, наличие в нем и использование дезинфицирующего раствора, его концентрацию.

Работники мясокомбината должны периодически проходить гигиенический инструктаж на специальных семинарах и занятиях с обязательной сдачей зачета по окончании занятий.

Помещения мясокомбината должны быть оборудованы устройствами механической вентиляции (вытяжная и приточно-вытяжная) для постоянного воздухообмена. В убойный цех, остывочную камеру, колбасный цех, кишечное отделение необходимо подавать кондиционированный воздух, т.е. содержащий определенное количество влаги, очищенный от примесей, нагретый до определенной температуры.

Отопление на мясокомбинате рекомендуется водяное, с гладкими, удобным для очистки радиаторами. Все производственные помещения должны иметь прямое естественное освещение с боковыми, верхними или теми и другими проемами. В некоторых помещениях солнечный свет неблагоприятно отражается на технологическом процессе (камера созревания мяса, остывочные и холодильные камеры). Все указанные помещения, как правило, бывают лишены естественного освещения.

При обследовании санитарного состояния холодильника необходимо обратить внимание на санитарное содержание камер, регулярность побелки, борьбу с плесенью стен, своевременность удаления конденсата на охлаждающих батареях (снеговая шуба), температурный режим и, что особенно важно, наличие специальной камеры для дефектного сырья (карантинная камера) с отдельным входом.

Все работники мясоперерабатывающих предприятий обязаны соблюдать правила личной и производственной гигиены. Под личной гигиеной подразумевается содержание в чистоте рук, личной и санитарной одежды, регулярное прохождение медицинского освидетельствования.

Работники производственных цехов и отделений мясоперерабатывающих предприятий обеспечиваются 2 комплектами санитарной одежды, которую меняют еженедельно или немедленно после загрязнения.

Работникам предприятия установлены следующие правила гигиены труда, которые они обязаны выполнять:

  • — приходить на работу в чистой одежде и обуви;
  • — запрещено закалывать санитарную одежду булавками или иголками, иметь карманы и пуговицы на халатах;
  • — волосы тщательно заправляться под косынку или колпак;
  • — запрещено в производственных помещениях предприятия курить и принимать пищу, для этой цели выделяют специальное помещение.

Лица, поступающие на работу, должны пройти медицинское обследование и инструктаж. Администрация предприятия несет ответственность за допуск к работе лиц, не прошедших медицинского обследования.

В случае убоя скота, больного инфекционными болезнями, при которых разрешается его переработка на мясо, к работе допускается ограниченный круг людей, прошедших специальный инструктаж. За ними устанавливают контроль со стороны ветеринарного и санитарного надзора. Рабочих, производящих убой больного скота, обеспечивают санитарной одеждой и средствами индивидуальной защиты (резиновые сапоги, перчатки, фартуки и др.). По завершении убоя производят тщательную уборку и дезинфекцию помещений, оборудования и инвентаря под наблюдением ветеринарного персонала.

Содержание в чистоте и порядке территории мясокомбината имеет для предприятия большое значение. На территории необходимо выделить площадку для мойки и дезинфекции транспорта, доставляющего животных на предприятие.

Ветеринарно-санитарные требования к различным производственным участкам представлены в разделе 1.5. При этом особое внимание уделяется последовательности технологических процессов и правильной расстановке оборудования (без перекрестного движения сырья и готовой продукции). Трубопроводы в цехах выполняют таким образом, чтобы можно было без затруднения производить очистку их, мойку и дезинфекцию. Трубы каждой системы (водопровод, газ и др.) окрашивают в разные по использованию светлые тона. На открываемые окна в наружных стенах устанавливают про-тивокомарную сетку. Инструменты, запасные части и мелкую тару хранят в специальных шкафах или кладовых. Переносное оборудование и тару маркируют.

Лабораторный контроль гигиены производства. На предприятиях мясной промышленности ветеринарная служба контролирует состояние территории, помещений, оборудования, платформы для выгрузки сырья и погрузки готовой продукции, площадку для мойки машин, коллектор сточных вод, водохранилище, водозаборные системы и оборудование в различных цехах.

Санитарное состояние производства и эффективность проведенных санитарных мероприятий контролируются ветеринарными врачами ежедневно визуально перед началом работы и после санитарной обработки, а также путем периодического проведения комплекса микробиологических анализов, включающих проверку технологического оборудования, тары, воды, воздуха и рук рабочих, соприкасающихся с продуктом. Если результаты санитарно-микробиологического контроля не соответствуют предельно допустимым нормам, то производится повторная санитарная обработка. Особое внимание следует уделять санитарному состоянию оборудования, которое соприкасается с готовым продуктом и полуфабрикатами. При этом периодичность отбора смывов, воды, воздуха должна быть занесена в Программу производственного контроля и в график лабораторного исследования.

Периодичность отбора проб питьевой (технической) воды. При производственном контроле контроль воды проводится 1 раз в месяц для каждой точки (для каждого цеха, лаборатории, столовой). Также необходимо осуществлять контроль технической воды (вода охлаждения оборудования) 1 раз в декаду. Вода, лед, используемые при производстве мясных продуктов, должны отвечать требованиям, предъявляемым к питьевой воде по микробиологическим показателям. В питьевой воде определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий и бактерий группы кишечных палочек по ГОСТ 18963-73 Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.

Бактериологическое исследование воздуха. В воздухе помещений, особенно где производится охлаждение и упаковка готового продукта, определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов и количество спор плесневых грибов (КМАФАнМ). Воздух обследуется седиментационным или аспирационным методами. Сущность седиминтационного метода заключается в том, что чашки Петри с питательным агаром и с сусловым агаром (или средой Сабуро для определения количества колоний плесневых грибов) оставляют открытыми в течение 20 мин в трех местах обследуемого помещения, затем закрывают и инкубируют в первом случае при температуре 37 °C в течение 72 ч, во втором — при температуре 25 °C в течение 5 сут. Воздух считается практически чистым, если на чашках с питательным агаром выросло в среднем до 200 колоний и на сусловом агаре — до 20 колоний проросших спор плесневых грибов.

При обследовании воздуха аспирационным методом используется прибор Кротова (инструкция по эксплуатации прилагается к прибору). Воздух считается практически чистым, если при про-сасывании 100 куб. дм воздуха на чашках с питательным агаром вырастает не более 150 колоний и на сусловом агаре — 15 колоний проросших спор плесневых грибов. Отбор проб воздуха на участках повышенной гигиены (колбасных, консервный цеха и др.) должен проводиться 1 раз в месяц; на участках где сырье, вспомогательные материалы и готовая продукция находятся в таре/упаковке, — 1 раз в декаду.

Исследование смывов с оборудования и поверхности стен. Проводится по специальным методикам.

Как правило, в течение месяца с каждой единицы оборудования, которая соприкасается с продуктом, сырьем, должны быть взяты смывы. Для контроля периодичности отбора в лаборатории должен быть график отбора смывов. Смывы с рук, рабочего инвентаря (ножи, мусаты и т.п.), спецодежды должны проводиться не реже 1 раз в неделю. Во время проведения санитарных дней на производстве (1 раз в месяц) необходимо осуществлять контроль очистки труднодоступных участков (трубопроводы, соединения, прокладки соединений и т.п.). Во время контроля учитывают целостность деталей (изношенность, разрывы прокладок и т. п.), состояние поверхностей деталей (отсутствие следов коррозии). Особое внимание уделяют «мертвым зонам»: на этих участках не должно быть остатков продукта.

Взятие смывов со стен и поверхности оборудования производится с помощью увлажненных стерильных ватных тампонов на металлических стержнях или салфеток (5x5 см), которые заготавливаются заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливают по 10 см3 стерильного 0,1-процентного водного раствора пептона или физиологического раствора, при этом тампон остается над жидкостью, не касаясь ее. Перед взятием смыва тампон погружают в жидкость. Смывы с крупного оборудования и инвентаря, металлических коробов, деревянных ящиков, бочек берут с внутренней поверхности со 100 см2 с помощью шаблона (трафарета), сделанного из проволоки. Смоченным ватным тампоном или марлевой салфеткой отбирают поверхность, ограниченную шаблоном, во взаимно перпендикулярных направлениях. При взятии смывов с мелкого инвентаря обтирают всю внутреннюю поверхность предмета.

Смыв со стен холодильника для микроскопических исследований проводится по специальной методике, которая предусматривает отбор соскоба с определенной площади поверхности.

После взятия смыва тампон вновь погружают в пробирку со стерильной жидкостью, встряхивают и дают отстояться 2-3 мин. Из полученного материала отбирают 1 см3 для определения общего микробного числа и, если требуется, 1 см3 для определения наличия плесневых грибов. Для определения БГКП оставшуюся смывную жидкость вносят в 5 см3 среды Кесслера.

При обследовании трубопроводов и другого оборудования, где невозможно применить шаблон, проводится микробиологический анализ последних порций промывных вод (около 100 см3), взятых после мойки оборудования. 1 см3 промывных вод или тампон после взятия смыва, в случае анализа только на БГКП, помещают в 5 см3 среды Кесслера.

При взятии смывов с рук увлажненным стерильной жидкостью тампоном протирают ладонные поверхности обеих рук сначала вдоль, потом поперек, затем межпальцевые пространства, ногти и подногтевые пространства. С перчаток берут смывы только со стороны ладоней. Тампон погружают в 5 см3 среды Кесслера.

Смыв с рабочей одежды берут с наиболее загрязненных участков одежды (рукава). Определяют БГКП, КМФаМ. Смыв берут с одежды работника в процессе работы и с чистой спецодежды после дезинфекции (для контроля качества дезинфекции).

Микробиологический контроль сточных вод мясокомбината. Для контроля за сточными водами на мясокомбинатах должна быть организована специальная лабораторная группа или отделение в составе лабораторий. Производят плановые анализы воды, согласно действующим санитарным правилам для мясокомбинатов, и внеплановые. Внеплановые анализы проводят в случае неблагоприятной эпидемиологической ситуации в зоне предприятия, а также при наличии достоверных сигналов о распространении с мясокомбината возбудителей инфекционных заболеваний. Микробиологические анализы сточных вод по показаниям производят согласно «Инструктивно-методическим указаниям по обнаружению возбудителей кишечных инфекций бактериальной и вирусной природы в воде», утвержденным главным государственным санитарным врачом страны.

Пробы воды для микробиологического анализа отбирают в стерильные флаконы, бутылки с притертыми корковыми и каучуковыми пробками, покрытыми сверху бумажными колпачками, в количестве не менее 500 мл при соблюдении правил стерильности. Место отбора устанавливают в зависимости от цели; если в воде содержится повышенное количество остаточного хлора или хлорамина, то во флакон, предназначенный для отбора 500 мл воды, до стерилизации вносят 10 мг серноватистокислого натрия (дехлоратор).

Пробы сточной воды на различных этапах очистки и после полного обеззараживания отбирают стерильными металлическими черпаками на ручках либо бутылками, укрепленными винтовым зажимом на металлическом стержне. Пробы воды берут с глубины до 0,5 м. Ее исследуют не позже чем через 2 ч после отбора, анализ допускает проводить не позднее 6 ч с момента взятия пробы, сохраняя при этом пробу при 1-5 °C. Отобранные пробы сопровождаются документом, содержащим наименование, дату, час, место взятия пробы, цель исследования, кем взята проба.

Перед посевом пробу воды тщательно перемешивают, остерегаясь замачивания пробки. Для определения общего количества бактерий в 1 мл готовят ряд последовательных десятикратных разведений: для неочищенной сточной воды — 1:10 000, 1:1000 000, 1:1 000 000; для воды, очищенной на биохимических очистных сооружениях (после вторичных отстойников) и хлорирований, — 1:10, 1:100, 1:1000. Посев производят общепринятым методом не менее чем из двух раз-ведений в 2 чашки Петри из каждого разведения. На чашках Петри при правильно выбранных разведениях должно вырасти не менее 30 и не более 300 колоний. На МПА выращивают посевы при 20 °C в течение 48 ч или при 37 °C в течение 24 часов, после чего подсчитывают и определяют с учетом посеянного объема количество микробов в 1 мл воды. Количество бактерий группы кишечной палочки определяют методом прямого посева и бродильным методом (коли-титр). Обнаружение в воде бактерий группы кишечных палочек следует рассматривать как показатель фекального загрязнения воды, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения.

Метод прямого посева пригоден для исследования нехлориро-ванной сточной воды. Точно 1 мл соответствующих разведений воды распределяют равномерно шпателем по поверхности среды Эндо, разлитых в чашках Петри. Для подсушивания чашки Петри оставляют в термостатах на 1 ч закрытыми не полностью. Затем посевы оставляют в термостате при 37 °C в течение 24 часов. Коли-титр устанавливают путем деления посеянного объема воды на количество выросших колоний, типичных для кишечной палочки. Отсутствие в посевах колоний бактерий группы кишечной палочки дает окончательный отрицательный ответ. Очищенную и хлорированную сточную воду исследуют бродильным методом.

Исследованию подлежат следующие объемы воды: из сточной до очистки — 0.001 мл (0,001, 0,0001, 0,00001 и 0,000001 мл), из сточной после очистки — 1,01 мл (1,0; 0,1; 0,001; 0,0001 мл). Результат анализа выражают в виде коли-титра.

Общая бактериальная загрязненность и количество бактерий группы кишечной палочки в сточной воде находятся в прямой зависимости от температуры воды и степени ее загрязнения. Количество бактерий в сточной воде, поступающей на очистную станцию, колеблется от 500 тыс. до 4 млн в 1 мл и от 100 тыс. до 400 тыс. бактерий группы кишечной палочки.

Эффективность очистки сточной воды на очистных сооружениях выражают в снижении бактериальных загрязнений по отношению к их содержанию в неочищенной или осветленной (после механической очистки) сточной воде.

Устойчивый процесс очистки сточных вод на станциях с полной биологической очисткой обеспечивает снижение бактериальных загрязнений в среднем при механической очистке на 30-40%, при полной биологической очистке на 90-95 %. Хлорирование повышает эффективность снижения бактерий на станции до 99,9%.

Сточные воды считают достаточно обезвреженными, если коли-титр в них при спуске в открытые водоемы не менее 1 мл.

Допустимые уровни микробной обсемененности различных производственных участков представлены в таблице 3.

Контроль качества санитарной обработки (мойки и профилактической дезинфекции) возможно проводить с использованием приборов, принцип работы которых основан на применении био-люминисценции аденозинтрифосфата (АТФ), то есть вещества, присутствующего в клетках животного и растительного происхождения, а также в различных микроорганизмах (это осуществляется в соответствии с дополнением к «Инструкции по санитарной обработке технологического оборудования и производственных помещений на предприятиях мясной промышленности», утвержденной 14.01.2003 г.).

Метод биолюминесценции АТФ основан на реакции, которая в природе встречается у светлячков Photinuspyralis, катализируемой энзимомлюциферином, в результате чего происходит излучение света. В основе настоящей методики лежит следующая биохимическая реакция: АТФ + реагент (люцифирин-люцифераза) = АМФ + PPi + световое излучение (где АМФ — аденозинмонофосфат, РР — пирофосфат).

АТФ используется в качестве количественного индикатора, определяющего присутствие различных клеток на исследуемых поверхностях. Соответственно АТФ-метрию можно использовать для оценки санитарного состояния поверхностей в режиме реального времени. Наличие органических остатков указывает не только на некачественную санитарную обработку, но и является источником питательной среды, способствующей развитию различных микроорганизмов. В приборе «LumitesterPD-Ю» и реагентах к нему «LuciPacW» была применена новая разработка — принцип биолюминисцентной циклической реакции при использовании пируватортофосфат дикиназы(РРОК).

Программа производственного лабораторного контроля за эффективностью обеззараживания сточных вод должна быть согласована с центрами территориального Госсанэпиднадзора. Пробы

Таблица 3

Объект

Площадь взятия смыва/ объем пробы

Определяемые микроорганизмы

Допустимые нормы

Оборудование, инвентарь и другие объекты из нержавеющего металла

10 см2

БГКП

КМФАиА

Отс

Не более 100 КОЕ

Дисковый нож слайзера

Край циркулярного лезвия

БГКП КМФАиА

Отс

Не более 100 КОЕ

Инвентарь из полимерных материалов

БГКП КМФАиА

Отс

Не более 100 КОЕ

Крупный инвентарь

100 см2 (по шаблону)

БГКП КМФаМ

Отс

Не более 100 КОЕ

Руки работников

Вся ладонь и межпальцевая поверхность

БГКП КМФАиА S. aureus

Отс

Не более 100 КОЕ Отс

Спецодежда во время работы после дезинфекции

10 см2

БГКП КМФАиА

Отс

Не более 100 КОЕ После дезинфекции — отсутсвие м/о

Вода питьевая (технологическая)

500 мл

БГКП в 1 мл Термотелерантные Е. coli КМФАиА

Отс

Отс

Не более 100 КОЕ

Вода непитьевая (техническая)

500 мл

БГКП в 1 мл Термотелерантные Е. coli КМФАиА

Не более 20 КОЕ

Не более 10 КОЕ

Не более 1000 КОЕ

Микробная обсемененность различных производственных участков


Окончание табл. 3

Объект

Площадь взятия смыва/ объем пробы

Определяемые микроорганизмы

Допустимые нормы

Воздух

1 см3

КМФАиА Плесени

Зеленящие стрептококки

Не более 150 КОЕ Не более 15 КОЕ Отс

Сточные воды

1 000 мл

Контроль качества дезинфекции (при хлорированиии) — коли-индекс 1000 л, при остаточном хлоре не менее 1,5 мг/л (при термическом обеззараживании) — отсутствие спорообразующих и неспорообразующих м/о


сточных вод отбирают до и после обеззараживания сточной жидкости. Правила отбора, хранения и транспортирования проб на микробиологические показатели должны соответствовать методическим указаниям по методам санитарно-микробиологического анализа питьевой воды. При использовании реагентов для обеззараживания сточных вод необходимо немедленно после отбора пробы нейтрализовать остаточные количества дезинфектанта.

Микробиологический контроль мяса и других продуктов убоя животных. Микробиологическое исследование мяса и внутренних органов животных проводят во всех случаях, определенных правилами ветсанэкспертизы.

На исследование направляют мышцы сгибателя или разгибателя передней и задней (желательно перекрестно левой и правой) конечностей туши, покрытые фасцией, или куски других мышц длинной не менее 8x6x6 см, лимфатические узлы — поверхностный шейный или собственно-подкрыльцовый и наружный подвздошный вместе с окружающей их соединительной и жировой тканями, у свиней — поверхностный шейный дорзальный (при отсутствии патологических изменений в области головы и шеи) или подкрыльцовый первого ребра и надколенный, селезенку, почку, долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем без желчи. При подозрении на пастереллез дополнительно направляют долю легкого; на листериоз — головной мозг, на рожу свиней — трубчатую кость.

При исследовании мяса мелких животных (кроликов, нутрий) и птицы в лабораторию направляют тушки целиком. При исследовании соленого мяса, находящегося в бочках, образцы мяса и лимфатических узлов отбирают сверху, из середины и со дна бочки, а также берут на анализ рассол и трубчатую кость.

При подозрении на наличие возбудителя сибирской язвы от трупа и вынужденно убитых животных на исследование направляют ухо с той стороны, на которой лежало животное. Место отреза прижигают. От туш, полутуш, четвертин вынужденно убитых животных кроме мышц еще берут лимфатические узлы и трубчатую кость (от всех частей), а у свиней еще и подчелюстные лимфатические узлы. В случае возникновения подозрения на сибирскую язву в процессе убоя или разделки туш отбирают отечные ткани, пораженные участки тканей и органов и регионарные к ним лимфатические узлы и ухо, а от свиней, кроме того, подчелюстной лимфатический узел. Поверхности разрезов тканей прижигают. Образцы завертывают (каждый отдельно) в пергаментную бумагу или полиэтиленовую пленку, помещают в пакет и на нем указывают вид животного, номер туши, дату отбора. На отобранные образцы выписывают сопроводительный документ.

В лаборатории, из селезенки, печени, почек, лимфатических узлов туши или из уха и других пораженных тканей и органов готовят 2-10 мазков-отпечатков (в зависимости от характера поражений и предполагаемого диагноза). Мазки высушивают, фиксируют и окрашивают по Граму и одновременно 2 %-ным водным раствором сафранина, или 15-20 %-ным раствором генцианвиолетта в формалине (по Ребигеру), или 2 %-ным раствором метиленового голубого.

При наличии в мазках грамположительных палочек с обрубленными концами (по Граму) и палочек или цепочек с капсулами (при окраске раствором сафранина, метиленового голубого или генцианвиолетта) сообщают об обнаружении возбудителя сибирской язвы (предварительный ответ).

Одновременно производят посев подозрительного материала на чашку Петри и подсушенным мясопептонным агаром (МПА) и в мясопептонный бульон (МПБ). Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 часов.

Споровые формы возбудителя сибирской язвы можно обнаружить в мазках, приготовленных только из культуры, выращенной на искусственных питательных средах и из патологического материала, взятого от вскрытых трупов. В сомнительных случаях (по микроскопии и при исследовании несвежего материала) ставят реакцию преципитации. У культуры, выросшей на питательных средах, изучают морфологию возбудителя, подвижность, характер роста на МПА, МПБ и 5 %-ном кровяном агаре.

При необходимости проводят биологическую пробу на двух белых мышах, заражая их взвесью из пораженных тканей, приготовленной на физиологическом растворе, а при исследовании лимфатических узлов свиней — чистой культурой возбудителя, полученной при посеве патматериала на питательные среды; дополнительно исследуют на чувствительность к сибиреязвенному фагу постановкой теста «жемчужное ожерелье», на капсулообразование, свертывание желтка куриного яйца. При этом надо учитывать, что возбудитель сибирской язвы образует капсулу только в организме животного и при культивировании на средах с добавлением сыворотки крови, а на МПА и МПБ капсулы у бацилл не образуются.

Диагноз на сибирскую язву ставят на основании обнаружения в мазках капсулообразующих бацилл, характерного роста на питательных средах, отсутствие подвижности и при положительной биологической пробе. Если в мазках, приготовленных из патологического материала, возбудитель сибирской язвы не обнаружен, об разцы мышц, лимфатических узлов и внутренних органов дважды погружают в спирт и обжигают. Стерильно из внутренней части образцов (лимфатические узлы режут пополам) вырезают кусочки размером 2 х 1,5 х 2,5 см, из каждого производят посев в виде отпечатков в чашках на поверхность питательной среды с подсушенным МПА и элективной средой (Эндо, Левина, бактоагар Плоскирева). С желудочного пузыря делают соскоб, которым и проводят посев. После посева на плотные среды кусочки измельчают ножницами и вносят в 50 мл среды обогащения (селенитовый ф-бульон Кауфмана, Киллиана, Мюллера, хлористо-магниевая среда М) для накопления сальмонелл. Мышцы, лимфатические узлы помещают в один флакон, а органы — в другой. Наилучшей средой для роста S. choleraesuis,

S. typhisuis является среда Киллиана. Эти возбудители на селенитовом бульоне не развиваются. Посевы инкубируют при температуре 37 °C на средах Мюллера, Кауфмана, Киллиана в течение 12-16 ч, а на селенитовом бульоне и хлористо-магниевой среде М — 18-24 ч. Оптимальной температурой для накопления сальмонелл на селенитовом бульоне является 43 °C.

После встряхивания флаконов из сред обогащения производят высевы петлей (штрихами) на чашку Петри с диагностическими средствами: висмут-сульфитным агаром, агаром Эндо, бактоагаром Плоскирева. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18-24 ч, а на висмут-сульфитном агаре — 48 ч.

На МПА чаще всего отмечают колонии, характерные для возбудителей листериоза, рожи свиней, пастереллеза, кокковых инфекций и др. На диагностических средах Эндо, Левина, Плоскирева и висмут-сульфитном агаре выявляют типичные или подозрительные колонии на бактерии семейства кишечных (сальмонеллы, кишечные палочки).

У выделенных микроорганизмов изучают морфологические, тин-кториальные, культуральные свойства, способности их сбраживать салицин, сахарозу, образовывать каталазу, сероводород и вызывать гемолиз на кровяном агаре и конъюнктивит у лабораторных животных.

При исследовании мяса сначала определяют общую микробную контаминацию, затем идентифицируют выделенные микроорганизмы.

Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ). Метод микробиологического анализа по определению количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов основан на подсчете колоний, выросших на питательных средах при термостатировании посевов при температуре 30 °C с образованием колоний в течение 72 ч, видимых при увеличении в 2 раза.

Подготовленную пробу тщательно перемешивают. Взвесь отстаивают в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для приготовления последующих разведений.

Степень разведения навески для высева на плотные среды выбирают так, чтобы общее количество колоний, выросших на чашке, колебалось в пределах от 30 до 300. В чашку Петри вносят по 1 см3 разведенного продукта или смыва, заливают расплавленным и остуженным до 45 град, агаром (15-20 см3); размешивают. После застывания агара чашки переворачивают и помещают в термостат при температуре 30 °C на 72 ч. При необходимости допускается предварительный учет колоний через 48 ч с последующим подсчетом через 72 ч. Обработку результатов культивирования проводят согласно ГОСТ 26670-85. Количество микроорганизмов в 1 г (1 см3, см2) рассчитывают по формуле:

К = АВ/С,

где: К — количество микроорганизмов в 1 г (см3, см2), КОЕ/г; А — среднее арифметическое число колоний в чашке; В — разведение; С — масса, объём, поверхность (см3, см2).

Для вычисления среднего арифметического нельзя использовать посевы, где количество выросших колоний на чашках менее 30. Если при посевах оказалось, что во всех разведениях на засеянных чашках менее 30 колоний, в результатах анализа рекомендуется написать: «Рост единичных колоний при посеве (указать количество засеянного продукта)». При отсутствии роста колоний результаты выражают таким образом: «Количество микроорганизмов менее 1». Если на чашках, более чем на Уг их площади, имеется рост спорообразующих микроорганизмов или за счет споровых микроорганизмов подсчет изолированных колоний невозможен, в результате анализа следует написать: «Рост спорообразующих микроорганизмов». Результаты выражают в колониеобразующих единицах — КОЕ (г, см2, см3).

Бактериологический контроль в цехах колбасного и консервного призводства. Наиболее строгий лабораторный микробиологический контроль основного сырья и вспомогательных материалов предусмотрен в цехах колбасного производства. Для осуществления такого контроля была утверждена специальная инструкция, в которой были предусмотрены порядок и методы, проверенные работой.

С целью контроля за санитарным состоянием колбасного производства и выявления причин возможного микробного загряз нения вырабатываемой продукции на колбасных заводах (в цехах) проводят микробиологические анализы смывов с технологического оборудования, инвентаря, тары, санитарной одежды и рук работающих.

Микробиологические анализы проводят не реже одного раза в 15 дней, а также по требованию санитарного врача или начальника ПВК предприятия. График проведения микробиологических анализов с указанием конкретных объектов обследования утверждается начальником ПВК по согласованию с врачом ведомственной санитарной службы.

Пробы для анализов (смывы) берут до начала работы цеха с помощью тампонов, сделанных из ваты или марли, и трафарета, ограничивающего площадь смыва. Трафарет делают из проволоки или металлической пластинки в форме квадрата площадью 25, 50 или 100 см.

Для приготовления марлевого тампона салфетку размером 6x6см складывают вчетверо так, чтобы концы ее находились внутри. Затем тампон прошивают ниткой и погружают в пробирку, содержащую 1 мл физиологического раствора или водопроводной воды. Пробирку закрывают ватной пробкой. Конец нитки от тампона должен выходить из пробирки наружу на одном уровне с пробкой.

Для приготовления ватного тампона кусочек ваты наматывают на конец металлической проволоки или тонкой деревянной палочки и опускают в пробирку, содержащую 2 мл физиологического раствора или водопроводной воды. Пробирку закрывают ватной пробкой, через которую наружу выводят конец проволоки (деревянной палочки).

Тампоны (ватные или марлевые) должны находиться выше уровня жидкости.

Пробирки с тампонами и трафареты стерилизуют при температуре 120 °C в течение 20 минут.

Для взятия пробы на обследуемый объект накладывают про-фламбированный трафарет и ограниченную им поверхность объекта тщательно протирают извлеченным из пробирки (при помощи стерильного пинцета) смоченным тампоном в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Затем тампоны погружают в ту же пробирку. Площадь, с которой берут пробу (смыв), должна быть не менее 100 см2.

Проверку чистоты рук, работающих осуществляют с помощью смоченного стерильного тампона, которым протирают ладони, пальцы, межпальцевые и подногтевые участки рук и после этого тампон погружают в пробирку, из которой он был извлечен.

В ведомости записывают дату взятия пробы и ее порядковый номер, наименование цеха и обследуемого объекта. На пробирке тампоном ставят порядковый номер пробы.

Доставленные в лабораторию пробы доливают стерильной водой или физиологическим раствором из расчета приготовления разведения 1:10, а в случае необходимости (значительное загрязнение обследуемого объекта) — 1:100 и выше. После тщательного вращения пробирки с тампоном и добавленной стерильной водой или физиологическим раствором из полученного разведения производят посев.

Посевы производят в целях:

  • а) Определения общего количества микробов. Для этого 1 мл исходного разведения вносят на дно стерильной бактериологической чашки и затем заливают расплавленным и остуженным до температуры 43-45 °C мясо-пептонным агаром (МПА).
  • б) Выявление бактерий группы кишечной палочки. На поверхность среды Эндо вносят 0,1 мл разведения 1:10 и стерильным шпателем равномерно распределяют жидкость по всей поверхности среды. Для ускорения выделения в смывах бактерий группы кишечной палочки используют питательные среды «ХБ» (хинозол-бромкрезолпурпурная) и Хейфеца.

При посеве на среду «ХБ» или Хейфеца в стерильную пробирку вносят 1 мл исходного разведения (1:10) или тампоном и заполняют ее 6-7 мл питательной среды.

в) Выявление протея. В конденсационную воду свежескошенного МПЛ вносят ОД мл исходного разведения (отсев по Шукевичу).

Посевы помещают в термостат при температуре 37 °C и инкубируют:

  • — для определения общего количества микробов на 1 см поверхности в течение 48 часов;
  • — для выявления кишечной палочки (посев на среду Эндо) и протея по Шукевичу — 18-24 часов;
  • — для выявления кишечной палочки (посевы на среды «ХБ» и Хейфеца) — 13 часов.

По окончании срока инкубации посевов производят учет результатов. Количество колоний, выросших на МПА, подсчитывают, умножают на степень разведения материалов и делят на площадь поверхности трафарета, выраженную в квадратных сантиметрах.

П р и м е р: на МПА выросло 200 колоний. Это число умножают на степень разведения — 200x10 - 2000. Полученное произведение делят на площадь смыва (100 см) — 200:100 = 20. Число 20 и будет являться показателем количества микробов на 1 см поверхности обследованного объекта.

Микрофлору, выросшую на среде Эндо и скошенном МПА (по Щу-кевичу), подвергают микроскопическому исследованию, а в случае необходимости дополнительной идентификации пользуются общепринятыми методами.

На средах «ХБ» и Хейфеца учитывают изменение цвета среды. При наличии бактерий группы кишечной палочки в среде Хейфеца наступает помутнение, среда вначале (сразу же после изъятия из термостата) приобретает желтый цвет, а затем начинает зеленеть; цвет среды «ХБ» из фиолетово-пурпурного становится желто-зеленым.

О результатах проведенного бактериологического исследования лаборатория должна сообщить начальнику ОПВК и директору колбасного завода (начальнику колбасного цеха).

При обнаружении санитарно-показательных микроорганизмов (бактерий группы кишечной палочки, протея) на технологическом оборудовании, таре, инвентаре и др. или при наличии на 1 см2 свыше 1000 сапрофитных микробов должна быть немедленно проведена тщательная мойка и дезинфекция загрязненного объекта, после чего лаборатория проводит повторный микробиологический анализ поверхности обследуемого объекта.

На предприятиях мясной промышленности необходимо проводить микробиологический мониторинг производственной среды. Оценка микробиологического состояния производственной среды в разных цехах является гарантией стабильности выпуска продукции, безвредной для потребителя, выявления начальных отклонений и выработки соответствующих действий до возникновения ситуаций, приводящих к снижению качеств продукции.

Микробиологический мониторинг окружающей среды в вышеуказанных цехах должен охватывать:

  • — оценку бактериальной контаминации воздуха (КОЕ/м3);
  • — оценку бактериальной контаминации поверхности оборудования, стен и полов помещений в цехах, а также рук и одежды персонала;
  • — оценку эффективности очистки, мойки и дезинфекции помещений и оборудования.

Микробиологический мониторинг в принципе не может и не должен выявить все микроорганизмы, присутствующие в контролируемой среде. Он может только показать, что все объекты и производственной среде соответствуют установленным требованиям и предельно допустимые уровни бактериальной нагрузки не превышены.

Задачей микробиологического мониторинга является получение репрезентативной оценки бактериального состояния производственной среды.

Стабильно высокий уровень гигиенических условий производственной среды в цехах должен обеспечиваться:

  • — соответствующим проектом производства;
  • — технологическим оборудованием;
  • — системой ведения документации (рабочие инструменты и журналы, регистрация результата контроля);
  • — валидированными и сертифицированными процессами деконтаминации;
  • — надежным контролем технологических процессов;
  • — системой поддержания чистоты (уборка, дезинфекция);
  • — контролем персонала в цехах( соответствующая одежда, условия переодевания);
  • — эффективными программами гигиенического обучения персонала, квалифицированными специалистами.

Методы микробиологического тестирования воздушной среды. Микроорганизмы всегда присутствуют в воздушной среде контролируемой рабочей зоны, так как НЕРА — фильтры, используемые для очистки воздуха, не имеют абсолютной 100%-ной надежности даже тогда, когда работают в специфицированных условиях (класс чистоты А 10 и В 100).

Основной целью микробиологического контроля воздуха является определение уровня и спектра микробной контаминации, чтобы оценить вероятность ее проникновения в производимый продукт.

Для контроля микробной контаминации воздуха применяют два метода — пассивный (качественный) и активный (количественный).

При использовании активного метода применяют специальное оборудование и среды.

К числу наиболее популярных приборов относятся импакторы, центрифужные пробирки, пробоотборники, где применяется питательная агаровая среда.

Пассивный метод заключается в экспозиции плотной питательной среды в течение определенного периода времени в открытых чашках Петри.

Частицы, присутствующие в воздухе, со временем осаждаются на поверхность агара. Время экспозиции составляет от 15 минут до нескольких часов. Однако длительная экспозиция приводит к высыханию питательной среды и к ухудшению условий культивирования бактерий.

Этот метод широко распространен, и его применение целесообразно в сочетании с активным методом контроля микробной контаминации воздуха.

Открытые чашки Петри располагают в нескольких точках, в том числе в точках «наихудших условий». Время выдержки в открытом состоянии составляет 30 минут и несколько часов. В чистых зонах допускается рост одной, редко двух колоний.

Недостатком метода является выявление только крупных и оседающих микробных клеток и неопределенность отобранной для исследования пробы в объеме. Фактически данный метод является качественным и позволяет лишь выявить определенный спектр присутствующих микроорганизмов.

Активные приборы и методы для контроля микробной контаминации воздуха использутся реже, чем пассивный.

Для выбора приемлемого метода активного отбора проб следует учитывать следующие факторы:

  • — ожидаемую концентрацию КОЕ в воздушной среде;
  • — способность метода работать в условиях низкой концентрации;
  • — чувствительность бактерий к процедуре пробоотбора;
  • — время и продолжительность отбора пробы;
  • — свойства прибора (эффективность, объемы проб);
  • — возможность деконтаминации прибора.

Выбор прибора и правильность его использования являются областью ответственности специалистов предприятия производителя.

Учитывая приемлемость по основным характеристикам и удобство использования, рекомендуется применять аэрозольные пробоотборники типа «Флора 100» или « Био-тестРГ-3».

Возможно применение любого пробоотборника типа «Флора 100». Пробоотборники применяются для любого класса чистоты воздуха типа А С/100/С/1000/Д/10000.

Работа пробоотборника основана на разгоне воздушного потока до высокой линейной скорости с помощью многосопловой решетки и инерционном осаждении микроорганизмов на плотную питательную среду, установленную перпендикулярно потоку.

Пробоотборник «Флора 100» рассчитан на эксплуатацию при температуре от 0 до 50 °C при относительной влажности воздуха не более 80%.

Объемная скорость отбора проб — 180 л/мин, режимы отбора проб — 25,100, 250 и 2000 л, диапозон измеряемых концентраций микроорганизмов — 1-10 КОЕ.

Требования по метрологической проверке должны указываться в паспортных данных на прибор.

Пробоотборник оформлен в виде переносного портативного прибора, состоящего из корпуса, в котором смонтирован блок управления на печатных платах, аспиратора, аккумуляторной батареи и съемной ситовой решетки. Корпус и ситовая решетка выполнены из анодированного алюминиевого сплава. Лицевая панель с органами управления смонтирована на корпусе и герметично закрыта гибкой пластиной. Прибор снабжен съемным шнуром электричества с блоком питания.

При подготовке прибора к работе необходимо блок питания присоединить сначала к пробоотборнику, а затем включить в сеть. Съем ситовой решетки и замену любого элемента производить после отключения прибора и полной остановки двигателя аспиратора.

Подготовка пробоотборника «Флора 100» к работе требует определенных навыков. В стерильные чашки Петри разливают по 15+1 мл питательной среды и оставляют для застывания на ровной горизонтальной поверхности.

Снимают защитную крышку с сопловой решетки пробоотборника.

Поворотом против часовой стрелки снимают верхнюю часть корпуса с сопловой решетки, увлажняют ватным тампоном, смоченным в этиловом спирте, и профламбируют на пламени горелки до полного сгорания спирта. В случае повышенных требований к стерильности операций пробоотбора съемную часть корпуса следует стерилизовать либо в автоклаве при температуре 121 °C в течение 1 ч, либо в сухожаровом шкафу при температуре 16 °C в течение 1,5 ч.

Для контроля микробной контаминации рабочих поверхностей используют следующие методы:

  • — смыв;
  • — контактная пластина.

Репрезентативной считается проба, снятая с поверхности площадью от 24 см2 до 30 см2.

Если накопленные результаты текущего мониторинга свидетельствуют о постоянном присутствии определенной группы микроорганизмов, то для их идентификации может быть использован соответствующий тип питательной среды.

Смывы с поверхности проводят стерильным ватным тампоном, укрепленным на стеклянном или металлическом стержне, вмонтированном в ватно-марлевую пробку пробирки. В пробирке должно содержаться около 2 мл стерильной воды или физраствора. В чашке

Петри — по 20-25 мл питательной среды для бактерий и питательной среды для грибов и дрожжей. Перед исследованием чашки со средой выдерживают в термостате в течении 1 суток при температуре 30-33 °C. Проросшие чашки не используют.

Смывы проводят увлажненным тампоном с поверхности площадью 24-30 см2.

После взятия пробы проводят несколько раз по поверхности питательной среды в двух параллельных чашках Петри со средой 1 и 2. После отбора проб чашки помещают в термостат для инкубации при температуре от 30 до 35 °C в течении 48 ч (для среды 1) и от 20 до 25 °C в течении 72 ч (для среды 2). После истечения срока инкубации проводят подсчет колоний на двух параллельных чашках, делают мазки, фиксируют, окрашивают по Граму и микроскопируют. На результаты тестирования могут повлиять следующие факторы:

  • — угол снятия пробы и давление тампона;
  • — присутствие остатков дезинфектантов на поверхности;
  • — возможность повторного снятия мазка с того же участка поверхности.

Контактные пластины готовятся с соответствующей плотной питательной средой, разливаемой на специальные пластины таким образом, чтобы поверхность питательной среды выступала над краем чашки Петри.

При исследовании снимают крышку с чашки, и стерильная поверхность питательной среды накладывается на гладкую ровную поверхность. После снятия отпечатка эту поверхность необходимо обработать спиртом или другим дезинфектантом для удаления питательной среды. После инкубации в соответствии с температурой и сроками для используемых сред проводят подсчет колоний и микроскопируют окрашенные по Граму мазки. Метод контактных пластин подходит для тестирования гладких и ровных поверхностей, таких как рабочий стол, стены, пол, одежда и др.

Для определения микробной контаминации перчаток персонала используют следующий метод.

Отпечатки пяти пальцев каждой руки делают на поверхность плотной питательной среды, например, среды 1 и 2 (параллельно).

Чтобы касание было полным, рекомендуется делать скользящее движение пальцами по всей поверхности агара. Руки после контакта с агаром тщательно обрабатывают спиртом.

Рекомендуется следующая частота тестирования: не менее одного раза в смену для ПЗ, для других — от одного раза в неделю до одного раза в месяц, в зависимости от степени автоматизации технологического процесса.

Микробная контактная одежда персонала обычно определяется на предплечьях с помощью контактных пластин. Так же определяют микробную контаминацию на бахилах.

Можно применять метод смыва тампоном. Для этого делают смывы увлажненным тампоном с 4 участков, площадью по 25 см2 каждый, на нижней части двух рукавов, верхней передней поверхности комбинезона (халата) и шлеме.

Устанавливают чашку с питательной средой в держатель пробоотборника, верхнюю часть корпуса в исходное положение и фиксируют ее поворотом часовой стрелки.

Подключают блок питания к импактору и вставляют его в сеть переменного тока 220 В, 50 Гц.

При питании пробоотборника от встроенной аккумуляторной батареи (комплектуется по требованию заказчика) блок питания подсоединять к пробоотборнику не следует.

Нажимаем кнопку «Сеть», расположенную на левой стенке пробоотборника, загорится индикатор «Вкл».

Нажимают кнопку, имеющую маркировку требуемого объема отбираемого воздуха (25, 100, 250, 2000 л), при этом над кнопкой загорится красный световой индикатор и появится шум работающего аспиратора.

После отбора заданного объема воздуха индикаторная лампа гаснет.

Порядок работы пробоотборника от аккумуляторной батареи и от сети переменного тока одинаков.

При работе пробоотборника от аккумуляторной батареи необходимо не допускать ее разряда ниже 10 В. При напряжении менее 10 В возникает мигание зеленой индикаторной лампы «разряд»

Для повторного отбора пробы воздуха необходимо установить в импактор новую чашку Петри с питательным агаром и нажать кнопку требуемого объема.

После отбора пробы снимают верхнюю часть корпуса пробоотборника с сопловой решеткой, извлекают чашку Петри, закрывают ее крышкой и помещают в термостат для инкубации.

После инкубации проводят подсчет колоний на поверхности питательной среды.

Для расчета концентрации микроорганизмов в воздухе определяют наиболее вероятное число микробных частиц в пробе.

При количестве колоний, не превышающем 35, наиболее вероятное число колониеобразующих равно числу колоний. Если количество более 35, то наиболее вероятное число (Р) КОЕ определяется по формуле:

/ 1 1 1

P = N ------- + ------- + ...+ ----------1

N- 1 N-2 N - п!

где N — количество отверстий в сопловой решетке (N = 367); п — число колоний.

В таблице 4 представлены значения наиболее вероятного числа КОЕ для пробоотборника «Флора 100».

Концентрация микроорганизмов в пробе воздуха определяется путем деления числа колоний или наиболее вероятного числа КОЕ на объем отработанной пробы.

Таблица 4

п

Р

п

Р

п

Р

п

Р

п

Р

N

Р

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

И

12

1

1

32

33

63

69

94

108

125

153

156

206

2

2

33

35

64

70

95

110

126

154

157

205

3

3

34

36

65

71

96

111

127

156

158

206

4

4

35

37

66

73

97

112

128

157

159

208

5

5

36

38

67

74

998

114

129

159

160

210

6

6

37

39

68

75

99

115

130

160

161

212

7

7

38

40

69

76

100

117

131

162

162

213

8

8

39

41

70

78

101

118

132

163

163

215

9

9

40

42

71

79

102

119

133

165

164

217

10

10

41

32

72

78

103

121

134

166

165

219

11

11

42

45

73

81

104

122

135

168

166

221

12

12

43

46

74

83

105

123

136

170

167

222

13

13

44

47

75

84

106

125

137

171

168

224

14

14

45

48

76

85

107

126

138

173

169

226

15

15

46

49

77

86

108

128

139

174

170

228

16

16

47

50

78

88

109

129

140

176

171

230

17

17

48

51

79

89

110

131

141

178

172

232

18

18

49

53

80

90

111

132

142

179

173

234

19

19

50

54

81

91

112

133

142

181

174

235

20

21

51

55

82

93

ИЗ

135

144

183

175

237

п

Р

п

Р

п

Р

п

Р

и

Р

N

Р

21

22

52

56

83

94

114

136

145

184

176

239

22

23

53

57

84

95

115

138

146

186

177

241

23

24

54

58

85

97

116

139

147

187

178

243

24

25

55

59

86

98

117

141

148

189

179

245

25

26

56

60

87

99

118

142

149

191

180

247

26

27

57

62

88

100

119

143

150

193

181

249

27

28

58

63

89

102

120

145

151

194

182

251

28

29

59

64

90

103

121

147

152

196

183

253

29

30

60

65

91

104

122

148

153

198

184

255

30

31

61

67

92

106

123

150

154

199

185

257

31

32

62

68

93

107

124

151

155

201

186

259

187

259

217

325

247

406

277

510

307

656

337

902

188

261

218

328

248

409

278

514

308

662

338

913

189

263

219

330

249

412

279

518

309

668

339

926

190

265

220

333

250

415

280

523

310

674

340

938

191

267

221

335

251

417

281

527

311

681

341

951

192

269

222

338

252

422

282

531

312

687

342

965

193

271

223

340

253

425

283

535

313

694

343

979

194

273

224

343

254

428

284

539

314

700

344

994

195

275

225

345

255

431

285

544

315

707

345

1009

196

278

226

348

256

434

286

548

316

714

346

1025

197

280

227

350

257

438

287

553

317

721

347

1042

198

282

228

353

258

441

288

557

318

728

348

1059

199

284

229

355

259

444

289

562

319

736

349

1078

200

286

230

358

260

448

290

567

320

743

350

1097

201

288

231

361

261

451

291

571

321

751

351

1117

202

291

232

363

262

455

292

576

322

759

352

1139

203

293

233

366

263

458

293

581

323

767

353

1162

204

295

234

369

264

462

294

586

324

775

354

1186

205

297

235

372

265

465

295

591

325

783

355

1212

206

299

236

374

266

469

296

596

326

792

356

1241

207

302

237

377

267

472

297

601

327

800

357

1271

п

Р

п

Р

п

Р

п

Р

п

Р

N

Р

208

304

238

380

268

476

298

606

328

809

358

1305

209

306

239

383

269

480

299

611

329

819

359

1341

210

309

240

386

270

483

300

617

330

828

360

1382

211

311

241

389

271

487

301

622

331

838

361

1428

212

313

242

391

272

491

302

627

332

848

362

1480

213

316

243

394

273

495

303

633

333

858

363

1542

214

318

244

397

274

498

304

639

334

868

364

1615

215

320

245

400

275

502

305

644

335

879

365

1707

216

323

246

403

276

506

306

650

336

890

366

1829

367*

Определение микроорганизмов кокковых форм. При исследовании смывов, сырья и готовых продуктов чаще всего выделяют микроорганизмы различных кокковых форм. Появление на МПА мелких прозрачных или мутных колоний, иногда с различными пигментами, дает основание подозревать наличие кокковой микрофлоры (стрептококков, диплококков и стафилококков). Длина цепочки стрептококков зависит от питательной среды, на которой они растут: в крови образуют короткие цепочки, при культивировании в бульоне — длинные. Лучше рост наблюдается при добавлении к МПА 2 % глюкозы или 10% сыворотки крови, или 5% дефибри-нированной крови. При росте стрептококков на МПБ с 2% глюкозы бульон остается прозрачным, а на дно пробирки выпадает осадок.

Для выделения энтерококков делают посевы на щелочно-энтеро-кокковую среду (ЩЭС). Посевы выдерживают при 45 °C в течение 18 ч, при наличии энтерококков происходит диффузное помутнение среды.

Диплококки дифференцируются от стрептококков по способности расщеплять инулин в инулиново-сывороточной среде Гисса. При росте диплококка среда свертывается и краснеет. В МПБ диплококки дают равномерное помутнение с выделением обильного осадка.

Для выращивания стафилококков применяют питательный агар, агаровые среды с 5 % бараньей или кроличьей крови, а также среды обогащения (7,5 %-ный солевой мясопептонный бульон и 10%-ный глюкозный бульон). В качестве элективных сред используют молочно-солевой агар Петровича, желточно-солевой агар Чистовича, мясопептонный агар с 5 % бараньей крови. Эти среды содержат 6,5-7,5% поваренной соли, благодаря чему подавляется рост другой сопутствующей микрофлоры. В МПБ стафилококки дают равномерное помутнение с выпадением обильного осадка. На МПА стафилококки образуют колонии, которые благодаря пигментации могут быть золотистыми, кремовыми, желтыми, палевыми, белыми.

Стафилококки-аэробы и факультативные анаэробы сбраживают глюкозу в анаэробных условиях с образованием кислоты. Это свойство используют для дифференциации стафилококков от микрококков.

Присутствие патогенных стафилококков устанавливают по способности культур вызывать коагуляцию плазмы крови кролика и человека (наиболее важный и постоянный признак патогенности), растворение эритроцитов крови барана (гемолитическая активность), сбраживание маннита с образованием кислоты в анаэробных условиях и образование лецитиназы.

Культуру стафилококка, выращенную на МПА, пересевают на среду Чепмена с кристалл-виолетом. На ней патогенные стафилококки образуют фиолетовые и оранжевые колонии, а непатогенные не растут или растут с большим опозданием. Для реакции плазмо-коагуляции используют плазму крови кролика или сухую кроличью плазму. Для определения коагулазной активности стафилококков, выделенных от крупного рогатого скота, можно применять плазму крови крупного рогатого скота. Патогенные стафилококки вызывают свертывание плазмы, образовавшийся желеобразный сгусток не выпадает из пробирки даже при перевертывании ее.

Гемолитическую активность стафилококков определяют на питательном агаре с добавлением 5 % стерильной дефибринированной крови барана. Следует учитывать, что не все гемолитические штаммы стафилококка являются патогенными. В редких случаях встречаются штаммы, не вызывающие гемолиза эритроцитов барана, но обладающие патогенными и энтеротоксическими свойствами. Поэтому постановка реакции плазмокоагуляции в сочетании с гемолитическим тестом является важным признаком установления патогенности стафилококков.

Для дифференциации стафилококков от Str. faecalis, который дает положительную плазмокоагулазную реакцию, используют каталазный тест в реакции с перекисью водорода. Стафилококки образуют фермент — каталазу и дают положительный каталазный тест.

Лецитиназную активность стафилококков определяют на жел-точно- солевом агаре (среда Чистовича) по образованию зоны лецитиназы — просветленной зоны вокруг колоний. Значение желточной реакции для установления патогенности не является неоспоримым. Имеют место случаи выделения коагулазоположительных штаммов стафилококков из желточно-негативных колоний и наоборот.

Для выявления способности стафилококков образовывать энтеротоксин и при идентификации культур стафилококков, выделенных из продуктов, которые подозревают как источник пищевой интоксикации людей, проводят биологическую пробу на лабораторных животных.

Определение золотистых стафилококков. Метод основан на выявлении характерного роста бактерий на элективных средах, изучении морфологических свойств, постановке теста плазмокоагу-ляции. В пробирку с 6-7 см солевого мясопептонного бульона (6,5% NaCI) вносят 1 г продукта или 1 см3 разведения. При исследовании продуктов, содержащих большое количество соли (свыше 5%), дополнительно производят посев в 1-процентный глюкозный мясопептонный бульон. Посевы помещают в термостат при температуре 37 °C на 18-24 ч. Из сред обогащения (солевого, глюкозного бульонов) производят посев на элективные среды: желточно- или молочно-солевой агар или среду Байрд-Паркер «в модификации института питания АМН». Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 ч.

Подозрительные на стафилококки колонии (непрозрачные, золотистые, кремовые, эмалевые, лимонно-желтые, имеющие форму правильных дисков от 2 до 4 мм в диаметре, слегка выпуклые на молочно- и желточно-солевом агаре с радужным венчиком вокруг колоний, черные, блестящие с узким белым краем, окруженные прозрачной зоной — на среде Байрд-Паркер) микроскопируют с окраской по Граму по ГОСТ 18963-73, отсевают на скошенный агар и инкубируют при температуре 37 °C 18-24 ч. Число колоний, взятых для идентификации, не должно быть менее пяти. Стафилококки положительно окрашиваются по Граму, имеют шарообразную форму с диаметром 0,6-1 мк и располагаются часто в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда. С односуточной культурой ставят реакцию плазмоагуляции.

Реакция плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см3 плазмы (лучше кроличьей), разделенной изотоническим раствором хлорида натрия (физиологическим раствором) в пропорции 1:5 (1 см3 плазмы +4 см3 физиологического раствора), вносят петлю суточной культуры стафилококка. Для контроля одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной. Пробирки помещают в термостат при температуре 37 °C. Учет результатов плазмокоагуляции проводят через 2 ч. Реакция считается положительной, если сгусток образовался в течение 24 ч.

Существуют дополнительные тесты идентификации золотистых стафилококков, которые используются, когда требуется подтверждение неясных результатов при наличии санитарно-эпидемиологического неблагополучия.

Дополнительные тесты включают: постановку реакций на термо-стабильную ДНКазу, лецитовителлазу, разложение маннита в анаэробных условиях, определение активности кислой фосфатазы (Методические указания по санитарно-биологическому контролю на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами). В случае необходимости для определения количественного содержания коагулазоположительных стафилококков в 1 г продукта к 10 г подготовленной пробы прибавляют 90 куб. см стерильной жидкости, тщательно перемешивают, оставляют на 3-5 мин. Из надосадочной жидкости готовят разведения 1:100, 1:1000. По 0,2 см3 исследуемого материала не менее чем из трех последовательных разведений высевают на поверхность подсушенных (в термостате) элективных сред и растирают шпателем (по 5 чашек Петри на одно разведение). Посевы термостатируют при температуре 37 °C в течение 24-48 ч. Через 24 ч посевы просматривают и отбирают чашки, в которых выросло от 15 до 150 колоний, характерных для стафилококков. Отмечают типичные колонии и посевы вновь помещают в термостат на сутки. Через 48 ч из 3-5 типичных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Колонии подсчитывают. Находят общее арифметическое число колоний на пяти чашках одного разведения, умножают на 5 и степень разведения продукта (10, 100 и т.д.).

Определение бактерий рода сальмонелл. Метод основан на способности бактерий рода сальмонелл на дифференциально-диагностических средах образовывать специфические колонии и давать реакцию агглютинации с сальмонеллезными сыворотками.

К бактериям рода сальмонелл относятся грамотрицательные подвижные палочки с закругленными концами, длина варьирует от 1 до 3 мк, ширина от 0,5 до 0,6 мк. Сальмонеллы являются факультативными анаэробами. Оптимальная температура роста 37 °C, реакция среды слабощелочная (pH 7,2-7,4).

Навеску продукта в количестве 25 г засевают в 100 куб. см среды обогащения (магниевую или селенитовый бульон). Посевы помещают на 18-20 ч в термостат при температуре 37 °C. На второй день из сред обогащения делают высев в чашки Петри на плотные дифференциально-диагностические среды: висмут-сульфит агар (ВСА), среду Плоскирева, Левина или Эндо. Перед посевом среду необходимо подсушить в термостате. Чашки термостатируют при темпера туре 37 °C в течение 15-18 ч со средами Эндо и Плоскирева и 48 ч со средой ВСА.

На ВСА сальмонеллы образуют черные (или коричневые) с металлическим блеском колонии, цвет среды под колониями черный. Исключение составляют S. paratyphi, S.cholerasuis и ряд других, растущих в виде мелких серовато-зеленых колоний с черным центром и без него. Кишечная палочка образует бесцветные, зеленоватые или серые колонии или не дает рост.

На среде Эндо колонии сальмонеллы бесцветные, слабо-розовые, выпуклые, блестящие. На средах Плоскирева и Левина колонии прозрачные, голубоватые, бледные или нежно-розовые.

С диференциально-диагностических сред отсевают несколько колоний на трехсахарный агар с мочевиной или среду Клиглера с мочевиной. Посевы делают сначала штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом (два раза) в глубину столбика. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °C 24 ч. Учитывают способность культуры ферментировать глюкозу, лактозу и мочевину. Для сальмонелл характерно разложение глюкозы с образованием газа. Лактозу и мочевину не разлагают. Готовая среда — трехсахарный агар с мочевиной имеет розовато-малиновый цвет. Отсутствие изменения цвета скошенной поверхности указывает на то, что лактоза и сахароза не разлагаются исследуемой культурой. Желтое окрашивание столбика, образование газа (разрывы) и сероводорода (почернение) указывает на рост бактерий из рода сальмонелл.

Желательно со среды Клиглера или с трехсахарного агара отсевать на короткий пестрый ряд, включающий скошенный агар, и среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, мальтозой, рыбо-или мясопептонным бульоном для определения индола и сероводорода. Под пробку с бульоном помещают бумажки, смоченные уксуснокислым свинцом для определения сероводорода и раствором щавелевой кислоты для определения образования индола. Посевы термостатируют при температуре 37 °C в течение 24 ч.

Под колонией на агаре наблюдается окрашивание участков среды в черный цвет. Некоторые серологические типы сальмонелл из группы С растут в ВСА в виде мелких светло-зеленых или крупных серовато-зеленых колоний.

К сальмонеллам относятся бактерии, не разлагавшие лактозу, сахарозу и мочевину, ферментирующие глюкозу, маннит и мальтозу с образованием газа, продуцирующие сероводород и не образующие индол. Для окончательного заключения у выделенных культур должны быть изучены серологические свойства.

Для изучения морфологических и тинкториальных свойств сальмонелл из небольшой части каждой из 3-5 изучаемых колоний делают мазок, который окрашивают по Граму и исследуют на подвижность (в висячей или раздавленной капле). При обнаружении подвижных с закрученными концами грамотрицательных палочек (S.pullorum,

S.gallinaruv — неподвижные) остальную часть колонии растирают в конденсированной воде скошенного агара или в одной-двух каплях добавленного к нему стерильного бульона. Эту взвесь как исходный материал используют для дальнейших исследований,серологических и биологических свойств сальмонелл.

Сальмонеллы обладают двумя основными антигенными комплексами. Различают жгутиковые (Н) антигенны и соматические (О). Антигенная структура сальмонелл расшифровывается с помощью монорецепторных Н- и О-сывороток.

Серологические свойства изучают путем постановки реакции агглютинации на стекле односуточной культуры, выделенной с трехсахарного агара, с поливалентной агглютинирующей абсорбированной сальмонеллезной О-сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с этой сывороткой проводят идентификацию с помощью монорецепторных агглютинирующих адсорбированных О-сывороток. При помощи поливалентной сальмонеллезной и моновалентной О-сыворотки устанавливается принадлежность исследуемой культуры к одной из серологических групп сальмонелл. Для определения серологического типа культур используют Н-монорецепторные сыворотки первой и второй фаз.

Для реакции агглютинации с О-сыворотками берут односуточную культуру с верхней части, с Н-сывороткой — с нижней части скошенного питательного агара. В случае положительной реакции агглютинации с монорецепторными О-, Н-сыворотками делают окончательный вывод о присутствии в исследуемом образце сальмонелл.

При сомнительных результатах исследования реакцию агглютинации с поливалентной адсорбированной О-сывороткой основных серологических групп А, В, С D, Е проводят повторно.

При этом положительная агглютинация лучше просматривается в вогнутом зеркале от микроскопа, помещенном под предметное стекло, на котором ставилась реакция. Контролем служит капля физиологического раствора с внесенной в него испытуемой взвесью — в ней наблюдают равномерную муть. При отсутствии реакции взвесь исследуют с поливалентной адсорбированной О-сывороткой редких групп. При получении положительной реакции с поливалентной адсорбированной О-сывороткой групп А, В, С, D, Е производят реакцию агглютинации с отдельными монорецепторными

О-сыворотками. Получение положительной реакции агглютинации с монорецепторными О-сыворотками определенной серологической группы при характерном росте колоний на дифференциальной среде и обнаружении грамотрицательных подвижных палочек является основанием для установления наличия сальмонелл.

Одновременно с постановкой реакции агглютинации взвесь культуры засевают на трехсахарный (лактоза, сахароза, глюкоза) агар с мочевиной (среда Крумвиде — Олькеницкого в модификации Ковальчука). Посев делают сначала штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика агара; выдерживают посев при 37 °C в течение 16-18 ч. При сбраживании лактозы или сахарозы или всех трех углеводов скошенная поверхность и столбик окрашиваются в синий цвет (при индикаторе ВР), что наблюдается при росте кишечной палочки. При росте сальмонелл сбраживается только глюкоза. При этом окрашивается только столбик среды в желто-бурый цвет. Наблюдается разрыв агара со скоплением пузырьков газа, скошенная поверхность сохраняет исходный цвет среды. Наличие сероводорода определяют по изменению окраски столбика агара в черный цвет. При расщеплении мочевины вся среда окрашивается в красный цвет (без разрыва агара), что характерно для протея.

Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки и ферментирующие глюкозу с образованием газа и не ферментирующие лактозу и сахарозу, не расщепляющие мочевину и не образующие индол, относятся к роду сальмонелл и подвергаются дальнейшей серологической типизации. Культуру со среды Крумвиде—Олькеницкого исследуют повторно в реакции агглютинации, для установления типа сальмонелл ставят реакцию агглютинации с Н-сыворотками данной серологической группы, используя вначале сыворотки первой, а затем второй фазы. Для агглютинации отбирают культуру ближе к конденсационной жидкости в пробирке или саму жидкость, где особи более подвижны.

Для более полной биохимической типизации культуры производят посев ее в развернутый цветной ряд, включающий среды Гисса с маннитом, дультитом, ксилозой, инозитом, рамнозой, глицерин-бульон, бульон Готтингера для определения индола и сероводорода. Под пробку в пробирку закладывают полоски индикаторных бумажек: на индол бумажки, обработанные 12 %-ным горячим водным раствором щавелевой кислоты, на сероводород — обработанные насыщенным раствором уксуснокислого свинца. Индолообразо-вание можно определить методом Эрлиха — подслаиванием 0,5 мл реактива парадиметиламинобензоальдегида в этиловом спирте с несколькими каплями соляной кислоты под слой эфира на 20-24-часовую бульонную культуру в пробирке. При обнаружении типичных по морфологическим и ферментативным свойствам культур, но не агглютинирующихся сальмонеллезными О- и Н-сыворотками для решения вопроса о принадлежности их к роду сальмонелл применяют универсальный О-фаг, способный лизировать почти все виды сальмонелл, не лизируя других бактерий семейства кишечных. Чувствительность к этому фагу указывает на принадлежность культуры к роду сальмонелл.

Восстановить агглютинационные свойства выделенной культуры можно путем повторных (3-5 ) пересевов на 10 %-ный желчный бульон и скошенный агар с последующим посевом на чашку Петри со слабощелочным агаром и отбором типичных колоний или путем парентерального заражения белых мышей с последующим выделением испытуемой культуры от павших животных.

Если выделенная культура не типична по ферментативным свойствам, но избирательно агглютинируется определенными сыворотками, то ее относят к роду сальмонелл. Если культура по ферментативным свойствам не типична и агглютинируется несколькими сыворотками разных серологических групп, то ее не относят к роду сальмонелл.

При невозможности типизации культуры на месте ее необходимо направлять для расшифровки в соответствующие научно-исследовательские учреждения. Следует иметь в виду, что продукты, инфицированные нетипичными штаммами сальмонелл, должны рассматриваться как опасные для здоровья человека.

В настоящее время предложен экспресс-метод выявления и идентификации патогенных микробов при помощи флуоресцирующих антител в течение 2-6 ч. Этим методом выявляют возбудителей рожи свиней, сальмонеллеза, листериоза. Метод основан на способности антител иммунных сывороток соединяться со специальными красителями (флуорохромами) и при вступлении в специфическую связь с соответствующими антигенами (комплекс антиген — антитело) светиться при люминесцентной микроскопии. Специфическое свечение микробных клеток, окрашенных соответствующего вида флуоресцирующей сывороткой, характеризуется тем, что по периферии они светятся сильнее за счет толщины и положения клетки в препарате. Из 2-3 типичных колоний, выросших на плотных питательных средах, готовят мазки на предметных стеклах ближе к узкому краю соответственно числу сывороток, которые должны быть применены для исследования. Мазки готовят средней густоты размером не более 1 см2. На одном стекле можно готовить не более 3 мазков. Мазки подсушивают на воздухе, маркируют и фиксируют этиловым спиртом

15 мин в вертикальном положении в сосуде. После фиксации и испарения спирта мазки ополаскивают физиологическим раствором с фосфатным буфером pH 7,4. На слегка подсушенный мазок наносят 1-2 капли соответствующей флуоресцирующей сыворотки в рабочем разведении. Мазки с сывороткой помещают на мостике во влажную камеру (в чашки Петри с влажными тампонами из ваты или фильтровальной бумаги) и выдерживают в температуре при 37 °C в течение 15 мин или при комнатной температуре в течение 30 мин, затем сыворотку отмывают, погружая мазки в кювету, содержащую физиологический раствор с фосфатным буфером pH 7,4, на 20 мин, меняя раствор 4-5 раз. Мазки ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе (можно пользоваться настольным вентилятором). Для повышения флуоресценции микробов мазки перед микроскопией увлажняют каплей глицерина и буфера pH 8,0 и накрывают покровным стеклом. На стекло наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло или его заменитель и производят люминесцентную микроскопию.

Интенсивность свечения сальмонелл, окрашенных антителами, меченными флуоресцинизотиоцианатом, оценивают по четырехбальной системе:

  • (++++) — сияющее зеленовато-желтоватое свечение контура (ободка);
  • (+++) — яркое зеленовато-желтоватое свечение ободка;
  • (++) — умеренное желтовато-зеленоватое или беловатое свечение хорошо заметного контура;
  • (+) интенсивность свечения — слабое свечение еще различимого контура;
  • (±) — клетки в виде сероватых теней, контур почти не улавливается или еле заметен на отдельных участках периферии клеток (не у всех микробов);
  • (-) — свечение клеток отсутствует или очень слабое, неопределенного цвета, бесконтурное, равномерное или слабозернистое, очертания клеток неясные (такое же свечение у неокрашенных клеток).

Результат микроскопии считается положительным при обнаружении свечения типичных для сальмонелл форм, оцениваемого не ниже, чем на два креста, при условии, что в параллельных препаратах, окрашенных гетерологичными сыворотками, оно отсутствует; свечение на один крест — реакция сомнительная, и исследование повторяют; оценка (-) или (±) — реакция отрицательная. Собственное свечение некоторых микробов может быть значительным, но если оно бесконтурное, то оценивается отрицательно.

С помощью флуоресцирующих антител можно обнаружить сальмонеллы в пробах мяса и внутренних органах убитых животных. В свежих пробах от убойных животных типичные формы сальмонелл можно обнаруживать в редких случаях. Поэтому проводят накопление сальмонелл в кусочках органов и тканей размером 2x3x4 см в закрытой чашке Петри в термостате при 37°C в течение 6-7 ч. Пробы, поступившие в несвежем состоянии, исследуют тотчас. Препараты готовят в виде отпечатков на стекле в трех сериях (по три мазка из каждого органа, обязательно из глубоких участков). Препараты должны быть тонкие. Технику приготовления и окрашивание мазков выполняют так же, как при исследовании культур. Мазки из костного мозга после фиксации спиртом дополнительно обезжиривают ацетоном в течение 5 мин при 2-3-кратной смене его. Для окрашивания препаратов применяют флуоресцирующие сыворотки: В1, DI, С1, смесь сывороток В и смесь сывороток С.

Если в препаратах, окрашенных смесью сывороток, обнаруживают положительное свечение, для уточнения группы сальмонелл готовят мазки-отпечатки и окрашивают их раздельно теми сыворотками, которые были взяты в смесь. Результаты учитывают так же, как и при исследовании культур.

При люминесцентной микроскопии препаратов-мазков, приготовленных из материала убитых животных, иногда имеет место неспецифическое свечение гетерологической микрофлоры и тканевых элементов. Одним из лучших способов повышения специфичности иммунофлуоресцентного исследования является контрастирование неспецифического свечения посторонней микрофлоры тканевых элементов с помощью бычьего альбумина, меченного родамином и эвансом синим. При этом гетерологичная микрофлора и тканевые элементы приобретают кирпично-красное свечение, контрастное по цвету золотисто-зеленой люминесценции сальмонелл.

Положительный результат на сальмонеллы оценивают при получении положительного результата первичной люминесцентной микроскопии или после подращивания микробов в пробах мяса или патологическом материале. Результат, полученный с помощью флуоресцирующих антител, является предварительным, требующим подтверждения бактериологическим анализом.

Определение бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий). Метод основан на способности бактерий группы кишечных палочек сбраживать в среде Кесслер лактозу с образованием кислоты и газа. В этой группе определяются 5 родов энтеробактерий (Е. coli, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Seratia).

Бактерии группы кишечных палочек (БКГП) — это аэробные и факультативно-анаэробные грамотрицательные, не образующие спор палочки, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 ч (бродильная пробирка), не обладающие оксидазной активностью.

Обнаружение на агаре Эндо круглых выпуклых, с ровными краями, красных, с металлическим блеском или без него, розовых с красным центром или бледно-розовых колоний, на агаре Левина (эозин-метиленовый синий агар) темно-фиолетовых колоний, на агаре Плоскирева кирпично-красных колоний с глянцевой поверхностью вызывает подозрение на присутствие бактерий рода Эшерихий коли. Для установления принадлежности выделенных бактерий к роду Эшерихий их дифференцируют от других сходных микробов по биохимическим свойствам.

Род Эшерихий объединяет грамотрицательные, короткие, полиморфные, чаще подвижные палочки, не образующие спор, растущие на простых питательных средах, не утилизирующие цитрат аммония. Бактерии рода Эшерихий образуют индол, дают положительную реакцию с метилоротом, дедуцируют нитраты в нитриты, дают отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра, не разжижают желатина, не образуют сероводорода, не обладают окислительным ферментом-цитохромоксидазой, не расщепляют мочевины. Культуры E.coli являются факультативными анаэробами, быстро ферментирующими глюкозу до кислоты и газа, маннит до кислоты, непостоянно — лактозу, арабинозу, рамнозу, ксилозу, сахарозу, раффинозу, дульцит, салицин, сорбит; не ферментируют адонита и инозита.

Присутствие в мясе и мясопродуктах энтеропатогенных серова-риантов E.coli устанавливают серологической типизацией культур Е. Coli с помощью типоспецифических сывороток.

Для определения БКГП 10 г продукта и 10 см3 (1 г) исходного разведения продукта засевают во флаконы со 100 и 40-50 см3 питательной среды соответственно. 1 см3 и 0,1 см3 и т.д. исходного разведения продукта засевают в пробирку с 5 см3 питательной среды. Засевается то количество продукта, в котором нормируется отсутствие бактерий группы кишечных палочек. Допускается засевать 1 г продукта в 8—10 см3 питательной среды.

Для определения БКГП в смывной жидкости с оборудования и рук тампоны или марлевые салфетки опускают в пробирки с 5 куб. см среды Кесслер. Посевы инкубируют при температуре 37 °C. Через 18-24 ч из газположительных пробирок и колб со среды Кесслер проводят посев на плотную дифференциальную среду Эндо и инкубируют при температуре 37 °C в течение 24 ч.

При наличии на среде Эндо колоний (красных с металлическим блеском и без него, розовых), характерных для группы кишечных палочек, производят их изучение. Из изолированных колоний готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамотрицательных без спор палочек делают заключение о присутствии БКГП. Желательно при обнаружении грамотрицательных, не образующих спор палочек выполнить также оксидазный тест. Для этого колонии со среды Эндо наносят шприцом на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную реактивом для определения ци-тохромоксидазы. В месте нанесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 1 мин, если бактерии имеют оксидазу.

При обнаружении бесцветных (лактозоотрицательных) колоний на чашках с агаром Эндо во избежание пропуска патогенных бактерий семейства кишечных палочек указанные чашки должны исследоваться дополнительно установленными методами.

Для выявления патогенных серологических сероваров Е. Coli используют первичные культуры грамотрицательных палочек, выращенные из материала на среде Эндо или Левина в чашках Петри. Суточную агаровую культуру Е. Coli, выращенную на косом агаре, смывают 4-5 мл стерильного физиологического раствора. Полученную суспензию (концентрация 5-6 млрд микробных тел в 1 мл) прогревают на водяной бане при 100 °C 1 ч для разрушения L и В поверхностных антигенов, препятствующих О-агглютинации. Охлажденную суспензию центрифугируют при 3000-4000 мин-1, надосадочную жидкость сливают, осадок исследуют в капельной РА на стекле с каждой комплексной колисывороткой (разведение 1:5).

Комплексные колисыворотки можно приготовить, смешивая типовые моновалентные сыворотки в равных соотношениях по группам:

a) 08,09,015,078,0101,0119;

b) 020, 035, 086, 0103, 0117, 0137, 018, 033;

c) 01,02,041,055,0115,0111,04;

d) 026, 0127, 0138, 0139, 0141, 0142, 0126, 0147, 0149.

При положительной РА на стекле с комплексной колисывороткой антиген исследуют в капельной реакции с отдельными типоспецифическими О-колисыворотками (разведение 1:10), входящими в состав комплексной сыворотки, а затем с этими же сыворотками, давшими положительную реакцию, в пробирочной РА в объеме 1 мл. Для этого типоспецифическую сыворотку разводят в пробирках физиологическим раствором, начиная с 1:100 до предельного титра, указанного на этикетке, и во все пробирки добавляют по две капли антигена (культуры, убитой кипячением). Контроль — антиген в физиологическом растворе и сыворотка в ее наименьшем разведении без антигена.

Пробирки встряхивают, выдерживают 12-16 ч при 37 °C, а затем при комнатной температуре 18-24 ч. Принадлежность к О-группе устанавливают по наивысшему разведению типоспецифической агглютинирующей сыворотки, вызвавшей агглютинацию антигена исследуемой культуры, которое должно быть не ниже половины предельного титра типоспецифической сыворотки.

Если все комплексные О-колисыворотки в капельной реакции не агглютинируют антиген из убитой нагреваемой культуры, то готовят из этого штамма суспензию бактерий и автоклавируют ее при давлении пара 0,1 мПа (120 °C) 2 ч для разрушения термостабильного А-антигена.

Автоклавированный антиген исследуют сыворотками 08, 09, 0101 в капельной и пробирочной реакциях.

Бактерии рода Proteus способны быстро распространяться по влажной поверхности питательных сред с образованием тонкой вуалеобразной, голубовато-дымчатой прозрачной пленки. Протей представляет собой грамотрицательные, полиморфные палочки, не образующие спор и капсул, подвижные в Н-форме. Для подтверждения присутствия вульгарного протея (Н-форма) производят посев в конденсационную воду скошенного агара (способ Шукевича). На среде Плоскирева протей растет в виде мелких изолированных полупрозрачных, нежных с неровными краями колоний, имеющих характерный запах. Бактерии этих колоний не имеют жгутиков, неподвижны (О-форма).

Результаты бактериологического исследования мяса и других продуктов убоя заносят в журнал установленной формы и оформляют протоколом. В лабораториях, проводивших диагностические исследования на выявление возбудителей II группы, ведут специальные журналы по утвержденной форме: регистрации бактериологического исследования материала от туш, органов (трупов) убойных животных, учета выделенных культур, их движения и уничтожения. Журналы должны быть пронумерованы, прошнурованы и скреплены печатью.

Определение колифагов. Метод определения колифагов в сточных водах. Определение колифагов в сточной воде проводится методом прямого посева 3 объектов: до очистки — 0,1 мл и 10,0 мл; после очистки — по 10,0 мл из одной пробы последующим учетом зон лизиса (бляшек) на газоне E.coliK12 F+ в чашках Петри с пита тельным агаром. Для контроля используют чашку с чистым газоном E.coliK12 F+ на питательном агаре.

За 24 часа до проведения анализа необходимо произвести посев детекторной культуры E.coliK12 F+ на косяк с питательным агаром. Перед проведением анализа сделать смыв бактерий 5 мл стерильной водопроводной воды и по стандарту мутности приговорить взвесь культуры E.coli в концентрации 109 бактериальных клеток в 1 мл. Расплавить и остудить до 45 °C 2 %-ный питательный агар (Хоттин-гера, МПА, на гидролизате кильки). Объем пробы 50 мл предварительно обработать 5 мл хлороформа путем интенсивного встряхивания в течение 15 минут и затем поставить пробу для полного осаждения хлороформа. Исследуемую воду внести в 3 стерильных чашки Петри по 10 мл в каждую. В остуженный питательный агар добавить смыв E.coli из расчета 1,0 мл смыва бактерий (в концентрации 109 бактериальных клеток в 1 мл) на 100 мл агара и осторожно перемешать. Полученной смесью по 15 мл залить сначала пустую чашку Петри (контроль газона E.coli), а затем все чашки, содержащие исследуемую воду. Содержимое чашек (10 мл пробы и 15 мл агара) осторожно перемешать легким покачиванием. Чашки оставить при комнатной температуре для застывания на 30 минут, затем перевернуть и дном вверх поместить в термостат на 18 часов при температуре +37 °C.

Учет производится путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 3 чашках Петри в посеянном объеме с последующим пересчетом результата, выраженного в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке колифаги должны отсутствовать. При наличии бляшек в контрольной чашке результат не учитывается. Необходимо повторить анализ с новой культурой этого же штамма E.coliK12F+, приготовленного из другой ампулы.

Определение сульфитредуцирующих клостридий (сульфит-восстановителей). Метод основан на способности клостридий вызывать почернение питательной среды определенного состава в результате образования сернистого железа. В навеску продукта массой 1 г или его разведение 1:10 (0,1 г), 1:100 (0,01 г) вносят пробирку с 10-13 куб. см питательной среды: сульфитполимиксиновой или Вильсон—Блера, предварительно расправленной и остуженной до 45 °C, или Китт-Тароцци.

Инкубацию проводят при температуре 37 °C 20-24 ч. При наличии роста клостридий в средах Вильсон-Блера, сульфитполимиксиновой образуется почернение. Из среды Китт-Тароцци, где наблюдается рост, пастеровской пипеткой производят пересадку на дно стерильной пробирки и заливают расплавленной средой ВильсонБлера высоким столбиком. При росте сульфитредуцирующих клостридий в результате восстановления сернистокислого натрия происходит взаимодействие его с хлористым железом, среда чернеет за счет образования сернистого железа. Изготавливают мазки препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Сульфитредуци-рующие клостридии представляют собой грамположительные палочки, располагающиеся в одиночку, попарно в виде цепочек или скоплений параллельных клеток (забором). При спорообразовании споры овальные или сферические, центральные, субтерминальные или терминальные. Сульфитредуцирующие клостридии каталазы не образуют, являются строгими анаэробами.

Для ускоренного определения сульфитредуцирующих микроорганизмов используют каталазную реакцию: к части культуральной жидкости добавляют 10-процентный раствор едкой щелочи или 10-процентный раствор соляной кислоты в таком количестве, чтобы питательная среда приобрела нейтральную реакцию (по индикаторной бумажке). Затем обезжиренной пипеткой 0,5 см3 жидкости переносят на профламбированное, обезжиренное и охлажденное до комнатной температуры предметное стекло, а затем другой пипеткой добавляют каплю 3-процентного раствора перекиси водорода. Если в течение 3 мин пузырьки газа не появились, считается, что микроорганизмы каталазы не образуют. Отрицательная проба на каталазу свидетельствует о присутствии в среде облигатных анаэробных микроорганизмов.

Наличие на MBA мелких росинчатых прозрачных колоний должно вызывать подозрение на рост возбудителей рожи свиней или листериоза, туляремии, пастереллеза, бруцеллеза и других инфекционных болезней этой группы.

Определение плесневых грибов и дрожжей. Метод основан на способности плесневых грибов и дрожжей расти на селективных средах в аэробных условиях при термостатировании посевов при температуре 25 °C.

По 1 куб. см исходного разведения, полученного при определении общей бактериальной обсемененности, высевают в чашки Петри и заливают по 15-20 см3 одной из питательных сред: сусло-агаром, Сабуро, синтетической с антибиотиками. Чашки вверх крышками ставят в термостат при температуре 25 °C. Через 5 суток просматривают посевы.

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Рост дрожжей сопровождается образованием выпуклых, блестящих, серовато-белых, кремовых колоний с розовым краем.

При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов проводят микроскопирование. Результаты микроскопирования оценивают по ГОСТ 10444.12-88.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

При определении в некоторых продуктах наличия или отсутствия плесневых грибов высевают непосредственно продукт и его разведение в 5-7 см3 питательной среды Сабуро. Посевы термостатируют при температуре 25 °C в течение 5 сут.

Гистологическое исследование мяса. Метод гистологического анализа используется при определении степени свежести и созревания мяса, а также позволяет установить, получено ли мясо от клинически здоровых или от павших животных.

Дли гистологического исследования от мясных туш берут три образца размером 30 х 30 х 30 мм: у зареза против 4-го и 5-го шейных позвонков (включая) зарез); у разруба грудной мышцы на уровне 4-го и 5-го ребра; разруба лонного сращения или от других частей туши, свежесть которых вызывает сомнение. Образцы вырезают в направлении, перпендикулярном поверхности мяса, не нарушая поверхностных слоев мяса и мест разруба. Из каждого образца вырезают два кусочка. Первый из них в направлении от поверхности в глубину длиной 15 мм, шириной 15 мм и толщиной 4 мм (в него должны войти поверхности разруба и туши), а второй является продолжением первого на глубину 30 мм. Мышечные волокна должны располагаться параллельно плоскости разреза. Кусочки мышц фиксируют в 10 %-ном водном растворе нейтрального формалина. Фиксированный в формалине материал может длительно храниться в банках. После фиксации для удаления формалина материал промывают в проточной воде в течение 10-15 мин.

Гистологические срезы готовят на замораживающем микротоме толщиной 15 или 30 мкм в плоскости, параллельной продольной оси мышечных волокон. Окрашивают срезы согласно установленным методикам, заключают под покровное стекло в пихтовый бальзам, после чего исследуют под микроскопом.

В гистологических срезах из мяса от клинически здоровых животных наряду с общим расслаблением мышечных волокон в первые часы после убоя животного наблюдают формирование грибовидных и тюльпановидных узлов сокращения. Они представляют собой локальные сверхсокращенные участки мышечных волокон в местах разрезов, разрубов поперечнополосатой мышечной ткани и в глубине мышц. Если надрезы мышц произведены после смерти животного (с целью фальсификации), то узлы сокращений совершенно отсутствуют. При исследовании мяса на свежесть и степень созревания устанавливают наличие в нем характерных микроструктурных изменений.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >