Изучение роли и места препарата алезан при инвазионных болезнях лошадей

Наукой и практикой накоплен большой опыт по применению в животноводстве различных антигельминтиков. Они относятся к различным классам соединений и, как правило, обладают эффективностью против узкого круга паразитов, что вынуждает владельцев животных применять для лечения и профилактики десятки препаратов, далеко не безупречных в экологическом отношении и не безвредных для организма животного.

В последние годы поиск высокоэффективных противопарази- тарных средств продолжается. Так, вслед за производными бензимидазолов были предложены для практики продукты биохимического синтеза, относящиеся к макроциклическим лактонам. Из них более глубоко и всесторонне изучен ивермектин.

Борьба с паразитами животных, и в частности лошадей, в настоящее время основывается на применении антигельминтиков и инсектицидов (в случае поражения гастрофилезом). Известен целый ряд противопаразитарных препаратов для лечения и профилактики гель- минтозов лошадей: эмботейп, панакур паста, эквисект паста, эквалан. Однако у каждого из них имеются свои недостатки - эмботейп при гельминтозах лошадей применяют в разных дозах; к панакуру и фен- бендазолу у лошадей развивается резистентность (Andrews et el., 1986; Викторов А.В., Дриняев В.А, 2002); эквисект паста задается крупным животным в больших дозах (Кленова И.Ф. и др., 2004); эквалан не оказывает действия на цестод (WO 01/60409 А, 23.08.2001).

Поэтому специалистов всегда интересовала возможность создания и применения лечебных средств с широким спектром действия, в том числе, нематодозов и цестодозов.

Совместно с С.В. Енгашевым в 2005 году разработали новый антигельминтный препарат в форме пасты с содержанием по ДВ 10 % празиквантела и 2 % ивермектина.

Фармакотоксикологическая характеристика противопаразитарного препарата алезан

В ООО «Научно-внедренческий центр Агроветзащита», как уже сказано выше, разработан антигельминтный препарат в форме посты содержащий в качестве действующих веществ 10 % празиквантел и 2 % ивермектин.

Известно, что в 1979 году в научно-исследовательской лаборатории фирмы «Мерк» (Merk Sharp & Dohme Research Laboratories) был открыт новый класс природных веществ, продуцируемых лучистым грибком Streptomyces avermitilis; эти вещества, оказавшиеся исключительно эффективными против нематод всех видов, были названы авер- мектинами. В дальнейшем, путем небольшой химической модификации (гидрогенизации) одного из авермектинов был получен еще более эффективный антгельминтик, названный ивермектином (Easby S.M., 1984).

По структуре он относится к классу макроциклических лактонов. Его получают путем химической модификации (гидрирования двойной связи С22=С23) природного авермектина В1 и он может быть обозначен как Н2В1 (химический дериват авермектина В1).

Таким образом, ивермектин - не природное вещество и не может быть получен путем ферментации микроорганизма Streptomyces avermitilis, как авермектины А1, В1, А2 и В2. Кроме того, ивермектин не индивидуальное соединение, а смесь двух очень близких по строению веществ Н2В1а (>80 %) и Н2В1в (<20 %) (Викторов А.В., Дриняев В.А., 2002).

Ивермектин широко применяется для лечения различных паразитарных заболеваний, причем в очень малых концентрациях по сравнению с другими паразитицидами. Ивермектин обладает широким спектром противопаразитарного действия, применяется орально, наружно и подкожно в виде инъекций (Craig N Burkhart, 2000).

Высокая липофильность молекулы ивермектина замедляет выведение его из организма. Препарат обнаруживают в сыворотке крови, по крайней мере, через 28 часов после однократного перорального применения. Преимущественно ивермектин накапливается в печени и жировой ткани, где и метаболизируется. Независимо от способа введения, препарат выделяется в основном с желчью и фекалиями, а также (до 7 %) выделяется с молоком (Craig N Burkhart, 2000).

Достаточно полно изучен механизм действия этого препарата. В настоящее время считается общепризнанным следующий механизм действия препарата: в организме беспозвоночных ивермектин специфически связывается с глутаматзависимыми хлорными канала- ми/рецепторами, расположенными большей частью в глотательных и соматических мышцах. В результате увеличивается проницаемость мембраны для ионов хлора, блокируется передача нервно-мышечного импульса, наступает паралич и гибель паразита. (Викторов А.В., Дри- няев В.А., 2002).

У членистоногих паразитов (иксодовые и чесоточные клещи, вши, насекомые - личинки подкожного овода, носовых оводов и др.) ивермектин блокирует передачу нервных импульсов между нервным окончанием и клеточной мышечной ткани посредством усиления гам- мааминомасляной кислоты (ГАМК).

По мнению ряда исследователей, препарат не оказывает эмбрио- токсического, канцерогенного и мутагенного действия, также не влияет на репродуктивную функцию (Викторов А.В., Дриняев В.А., 2002).

Ивермектин является малотоксичным препаратом - ЛД50 для белых мышей - 25, для крыс - 50, для крысят 2-3 мг/кг, для собак - 80 мг/кг массы тела соответственно. При пероральном введении взрослым мышам ивермектин более токсичен для самцов, чем для самок. Эти дозы значительно превышают рекомендованные (Craig N Burkhart, 2000). У собак признаки токсикоза проявлялись мышечной дрожью, тремором, атаксией и обильным слюнотечением. При накожном введении ЛД50 составила для кроликов 406, для крыс более 660 мг/кг.

И.М. Гаджиев изучал параметры острой токсичности ивермектина на беспородных белых мышах массой 18 - 22 г. Он вводил его подкожно и наблюдал 3 дня. Методом пробит анализа Литчфилд Уилкок- сона установил, что ЛДо равна 50, ЛД16- 73, ЛД50- 80 (72,72+88), ЛД84- 91, ЛДюо- 125 мг на кг живой массы. Автор делает вывод, что ивермектин относится к малотоксичным соединениям, а ЛД50 почти в 400 раз превышает терапевтическую дозу.

Опытами, проведенными на 334 крысах (самках) массой 200- 240 г, из которых было 172 подопытных и 162 контрольных, установлено, что трехкратная доза ивермектина не вызывает эмбриотоксиче- ского и тератогенного действия. Автор вводил ивермектин в дозе 600 мкг/кг беременным крысам, то есть доза была увеличена в 3 раза. Препарат применял крысам с 1 по 17-й день беременности. По завершении опыта подсчитал количество желтых тел беременности, мест имплантации, количество живых, мертвых и резорбированных плодов.

Изучение мутагенной активности ивермектина проведено на самцах мышей. Им вводидили препарат подкожно в дозах 2000 мкг/кг, 600 мкг/кг и 200 мкг/кг. Ивермектин в дозе 2000 мкг/кг вызывал уменьшение числа беременных самок.

Подобный эффект вызывала доза 600 мкг/кг на стадиях поздних сперматид и сперматоцидов. Ивермектин в дозе 200 мкг/кг не влиял на оплодотворяющую способность самцов.

Данное соединение в дозе 2000 мкг/кг проявило мутагенный эффект на стадии поздних сперматоцидов. Величина постимплантационной смертности 34,1, а в контроле 16,0. В дозе 600 мкг/кг ивермектин проявлял мутагенный эффект на стадиях поздних и ранних сперматид. Больше было постимплатационной смертности по сравнению с контролем. Препарат в дозе 200 мкг/кг не проявил мутагенного действия. Ивермектин в этих же дозах при введении на 6, 24 и 48 часа не проявил цитогенетической активности в клетках костного мозга белых мышей.

Однократное введение крупному рогатому скоту ивермектина в дозе, в 30 раз превышающей терапевтическую, не вызывало никакого токсикоза. Только 40-кратное увеличение дозы приводило к отравлению с признаками слабости, апатии и нарушения координации движения. При 100-кратном увеличении дозы ивермектина, инъецированного свиньям, наблюдалась атаксия, тремор, затрудненное дыхание и мышечная дрожь (Ф.А. Волков, К.Ф. Волков, 1999).

Изучено влияние ивермектина на органы и ткани овец. 42 овцам подкожно вводили ивермектин в дозе 0,4 мг/кг. Животных убивали через 3, 6, 9, 12, 18 и 24 часа после введения ивермектина. От них брали кусочки органов для исследования. Никаких изменений во внутренних органах не было. Установлено, что при введении ивермектина овцам в дозе 0,8 мг/кг живой массы происходил токсический некроз тканей кишечника, печени и почек. Наблюдались дистрофия печени, нарушения кровообращения в печени, дистрофические изменения в клетках, изменения объема ядер гепатоцитов и эпителия слизистой кишечника и их деформация. Нарушалась целостность щеточной каймы и ворсинок слизистой оболочки кишечника.

О.И. Мамыкова изучала действие ивермектина на уровень первичного иммунного ответа к эритроцитам барана у мышей. Опыт проведен на беспородных белых мышах массой 18 - 20 г. Ивермектин вводили внутрибрюшинно. За сутки до инъекции подопытным мышам ввели внутрибрюшинно 0,5 мл суспензии эритроцитов барана. На 6, 10 и 20 сутки в сыворотке крови определяли уровень антител к тимусза- висимому антигену. Установлено, что ивермектин в терапевтической дозе ингибирует иммунную реакцию на тимусзависимый антиген. Установлена иммуносупрессивная активность ивермектина.

При изучении токсичности ивермектина на овцах, препарат вводили валушкам подкожно в дозах 200, 500, 1000 и 5000 мкг/кг. Установлено, что ивермектин, введенный в дозе, в 25 раз превышающий терапевтическую, не вызывает токсикоза. При двукратной подкожной инъекции с интервалом 14 суток в дозе 200 мкг/кг у овец не происходило изменений со стороны форменных элементов крови, белкового и азотистого обменов в организме.

Препарат не оказывал отрицательного действия на содержание аскорбиновой кислоты, активность глутатиона, ферментов переамини- рования и лейцинаминопептидазы в крови. При исследовании сердца, легких, печени, почки, селезенки, лимфоузлов, пищеварительного тракта у опытных животных никаких изменений не обнаружено. Ивермектин введенный в терапевтической дозе (0,2 мг/кг) овцам, не обладает эмбриотропным и цитогенетическим действием (С.В. Березкина).

В эксперименте на овцах установлено, что ивермектин в течение 5-7 дней вызывает угнетение Т- и В-систем иммунитета. По этой причине, как утверждают исследователи, сразу после дегельминтизации происходит сильная реинвазия (В.И. Колесников).

Имеются сведения, что в результате однократного введения ивермектина в терапевтической дозе наступает достоверное снижение В-клеточной популяции лимфоцитов с 20,90±0,87 % до 14,2±0,8 % (Р<0,05). Такой эффект наблюдается в течение 10 суток. К концу этого срока относительное число В-лимфоцитов достигало показателей, которые были у контрольных животных.

Изучение комплементарной розеткообразующей способности лимфоцитов позволило выявить возрастание абсолютного количества клеток в 1-й день введения препарата. В-клеточная популяция лимфоцитов снижалась до 15-го дня наблюдения. Авторы делают вывод, что это свидетельствует о супрессивном влиянии ивермектина на Т- систему иммунитета. Однократная доза антигельминтика стабильно снижала абсолютное и относительное содержание ЕА-РОК. На 10-й день число Т-лимфоцитов достигало минимальных значений. В последующие дни количество Т-лимфоцитов увеличивалась, но никогда не достигало уровня контрольных животных. Исследователи заключают, что ивермектин в дозе 0,2 мг/кг у интактных животных вызывает в не- значительой степени иммуносупрессию Т- и В-лимфоцитов при увеличении IgM, снижение концентрации IgG, незначительное повышение в течение 15 дней титра антител титрцентрации иммуноглобулина М и титра естественных антител (Э.Х. Даугалиева, В.В. Филиппов, 1991).

Влияние антигельминтиков на организм животных

В 1987 году ивермектин был рекомендован Главным управлением ветеринарии СССР для широкого применения при гельминтозах животных, а спустя год его отнесли к заслуживающим особого внимания препаратам, применяемым в гомеопатических дозах (0,2 мг/кг) (А.С. Бессонов, 1988).

При применении антигельминтной пасты для лошадей эквалан, содержащей 1,87 % ивермектина при параскариозе, оксиурозе, строн- гилятозах пищеварительного тракта и гастрофилезе в Казахстане Н.Т. Кадыров получил 100 %-ную эффективность против данных инвазий.

Эффективность при гастрофилезе составила 99,9 - 100 %. У пяти лошадей получавших трехкратно увеличенные дозы эквалана, видимых клинических изменений не было (Ю.М. Растегаев).

В сравнительном опыте на 107 лошадях при применении препаратов ивомек подкожно, дачи внутрь пасты эквалан и ивомек перорально в дозе 200 мкг/кг однократно, установлено, что ивомек вызывал гибель всех паразитов у лошадей, препарат эквалан - 99,2 - 99,9 % и ивомек при дачи внутрь 99,3- 100 %. Абсолютная эффективность ивомека при подкожном введении подтвердилась и в Туркмении. Ивомек и эквалан вызывали гибель 99- 100 % паразитов лошадей в Калмыкии и Туркмении. Аналогичные результаты были получены при смешанных паразитозах и при простмаириозе (И.М. Гаджиев, В.К. Иб- раев, М.В. Якубовский, Н.Ф. Карасев, Л.А. Бундина).

Против личинок разных видов желудочных оводов был применен ивомек интрамускулярно, однократно в дозе 1 мл на 50 кг массы тела. Уже через 18-24 часа личинки погибали и выходили наружу с фекалиями. Всего за 3 суток было собрано 1389 личинок. Из опытной группы на мясокомбинате было убито 14 лошадей. У них возбудители гастрофилеза отсутствовали (А.П. Камарли).

При габронематозе лошадей в Бразилии была получена 100 % эффективность ивермектина в дозе 0,2 мг/кг в форме оральной пасты (Bordin E.L. et all., 1987).

Получена 100 % эффективность ивермектина в дозе 200 мкг/кг в форме пасты у жеребят пони спонтанно инвазированных взрослыми особями и личинками Parascaris equorum (D.D. French, et all., 1988).

Исследователи E.T. Lyons, et all., (1988) отмечают, что ивермек- тин неэффективен против взрослых Oncocerca cervicalis, локализующихся в выйной связке, но губительно действует на микрофилярии О. cervicalis.

Об отсутствии активности ивермектина против взрослых Oncocerca cervicalis и Oncocerca reticulata отмечают также отечественные исследователи (Д.Ф. Клочков и др., 2005). Препарат в дозе 0,05 мг/кг оказался недостаточно эффективным против микрофилярий - эффективность составила 82,23 %, в дозах 0,1 и 0,2 мг/кг была получена 100 % эффективность против микрофилярий.

Празиквантел - краткое описание препарата

Празиквантел (2-циклогексилкарбонил-1, 3, 4, 6, 7, 11b-

гексагидро-2Н-пиразино[2,1-а]-изохинолинон.

Представляет собой мелкий кристаллический порошок от белого до кремового цвета, плохо растворимый в воде, растворяется в хлороформе, диметилсульфоксиде, алкоголе. Температура плавления 136 — 140 °С.

Препарат активен по отношению ко всем стадиям развития ленточных гельминтов, в т.ч. Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, Mesocestodes spp., Taenia spp., Dipylidium caninum, Difillobotrium latum (А.А. Кузьмин, 2001).

Механизм действия празиквантела основан на нарушении у це- стод транспорта глюкозы и микротубулярной функции, угнетении активности фумаратредуктазы и синтеза АТФ, повышения проницаемости клеточных мембран и нарушении мышечной иннервации.

Празиквантел быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта. Максимальная концентрация в плазме крови достигается через 1 час после орального введения. Период полувыведения из плазмы крови у овец оставляет 4,2 часа. Около 70-80 % препарата, находящегося в крови, связано с сывороточными белками. В небольших количествах накапливается в печени и почках, причем в виде метаболитов. Биотрансформируется в печени с образованием гидроксильных производных, а также конъюгатов с глюкуроновой и серной кислотами. Препарат выделяется в основном с мочой -до 55 %. Через 24 часа после введения концентрация препарата становится ниже предела обнаружения, 90% празиквантела экскретируется в течение 72-96 часов.

Токсичность. LD50 для лабораторных животных при пероральном введении варьирует от 1000 до 7000 мг/кг. Плотоядные способны переносить дозы, превышающие терапевтическую в 40 раз.

Препарат не обладает эмбриотоксическим, мутагенным, тератогенным и сенсибилизирующим действием (Демидов Н.В., 1982).

Ежедневная пероральная дача препарата в дозе 20, 60 и 180 мг на 1 кг массы тела в течение 4 недель не сопровождается появлением у животных признаков интоксикации, за исключением повышения в крови уровня щелочной фосфатазы у некоторых собак, получавших более высокую дозу празиквантела. Даже при ежедневной даче препарата в дозе 1000 мг на 1 кг массы тела в течение 4 недель или в дозе 180 мг на 1 кг массы тела в течение 12 недель у животных не появлялись клинические изменения. При использовании в рекомендуемых дозах препарат хорошо переносится, не вызывая нежелательных побочных реакций.

Препарат впервые синтезирован и запатентован в 1975 году фирмами «Merck» и «Bayer AG» (ФРГ) и предложен в качестве анти- гельминтика широкого спектра действия (синонимы: дронцит, Embay- 8440, бультрицид, цезол, пиквитон).

Празиквантел - малотоксичный препарат (терапевтический индекс 1:40), не обладает эмбриотропными и мутагенными свойствами, не влияет на постнатальное развитие (Дорошина, 1983).

Наиболее распространенной формой празиквантела являются таблетки под названием дронцит.

Однократное назначение дронцита собаками в дозе 5 и 10 мг/кг способствовало полной элиминации альвеококков (Nommel et al., 1976; Sakamoto, 1977; Thakur et al., 1979 и др.).

По данным Г.С. Гюльгязли (1977), дронцит в дозе 2,5 мг/кг при однократной даче показал при эхинококкозе эффективность 75,0- 95,5%, а в дозе 5 мг/кг - 91,6 - 100 %. А.С. Каснакбаев и др. (1981) отмечали 100% эффективность дронцита в дозе 5 мг/кг против эхинококков в возрасте 5, 18 и 31 дня, а также против неполовозрелых эхинококков и мультицепсов при смешанной инвазии на 35-й день после заражения собак.

В.В. Тищенко и Л.Г. Тищенко (1983) отмечали, что таблетки дронцита в дозе 5 и 10 мг/кг обладали 100% эффективностью против смешанной инвазии эхинококками, мультицепсами и тениями гидати- генными в возрасте 15, 30 и 60.

Andersen et al. (1985) применили против неполовозрелых эхинококков и альвеококков пасту празиквантела с фебентелом и установили 100% ее эффективность. На преимущество пасты перед празикванте- лом и фебентелом, примененными отдельно, указывали также Corwin et al. (1984) и Anther, Сох (1986).

Р.Э. Бекиров (1985) использовал лечебные кормовые гранулы с празиквантелом и показал, что в дозах 5 и 10 мг д.в./кг они обладали 100% эффективностью против 30-дневных эхинококков, мультицепсов и тений гидатигенных.

Материалы и методы экспериментальных исследований

Один из основных вопросов, возникающий перед токсикологическими исследованиями при изучении любого вещества - это изучение параметров острой токсичности препарата, его потенциальная опасность.

Острую токсичность определяли следующими параметрами - максимально переносимой дозой - ЛДо, средней смертельной дозой - ЛД50 (Машковский М.Д., 1959; Елизарова О.Н., 1962; Беленький М.Л., 1963; Машковский М.Д., 1971). Определяются также ЛД)6 и ЛДв4 для установления доверительных границ ЛД50 - средней смертельной дозы.

Изучение параметров острой токсичности проводили на основании «Методических рекомендаций по изучению общетоксического действия фармакологических свойств», утвержденных Минздравом России 29 декабря 2000 г. Изучение параметров острой токсичности пасты проводили на двух видах животных: 36 белых мышах массой тела 18 - 20 г. Животных перед опытом выдерживали на голодной диете в течение 4-6 часов. Препарат вводили с помощью иглы с булавовидным утолщением в желудок белым мышам в дозах от 0,05 мл до 0,125 мл.

После введения препарата проводили наблюдения в течение 5 дней, учитывая общее состояние животных, состояние шёрстного покрова, подвижность и чувствительность к внешним раздражителям.

Аллергенные свойства пасты изучали согласно «Методическим рекомендациям по оценке аллергенных свойств фармакологических средств» на 5 кроликах по конъюнктивальному тестированию. С этой целью пасту разводили на вазелине в 10 раз и вводили 1 каплю раствора под верхнее веко в дозе по 10 мг/кг по ДВ опытным животным, а контрольным- только вазелин. Реакцию учитывали через 15 мин (быстрая реакция) и через 24 - 48 часов (гиперчувствительность замедленного типа), и оценивали по следующей шкале (в баллах):

  • 1. легкое покраснение слезного протока;
  • 2. покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице;

3. покраснение всей роговицы и склеры

Реакцию непрямой дегрануляции тучных клеток определяли в соответствии с методическими рекомендациями по изучению иммунного статуса при гельминтозах животных (М., ВИГИС, 1988, 2000).

Изучение хронической токсичности пасты проводили на белых беспородных крысятах-самцах массой 150- 160 г. С этой целью крысятам ежедневно в течение 2-х месяцев вводили пасту в дозах 1/100; 1/1000 от ЛД50. Каждая экспериментальная и контрольная группы состояли из 10 животных. Контрольной группе (10 животных) при тех же условиях вводили равный объем физиологического раствора.

Антитоксическую функцию печени определяли гексеналовой пробой.

Кумулятивные свойства пасты изучали на 40 белых беспородных мышах массой 18 - 20 г методом Лима (Lim et all, 1961). Препарат вводили через рот в желудок в дозах 1/10 от ЛД50 до 50% гибели животных с вычислением коэффициента кумуляции (Ккум) - отношение суммарной дозы вещества, вызывающей гибель 50 % животных, к дозе, вызывающей гибель 50 % животных при однократном введении.

Эмбриотоксические и тератогенные свойства препарата изучали согласно «Методическим рекомендациям по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств» (1986).

Местное, кожно-резорбтивное действие оценивали по ряду специфических и интегральных показателей на стадии первичных реакций и в отдаленные сроки.

Переносимость антигельминтной пасты изучали на 15 лошадях в терапевтической и 3-х кратно увеличенной дозе. Изучали гематологические и биохимические показатели.

Кровь для исследований брали из ушной вены, мочу собирали в метаболитных камерах после водной нагрузки. Для определения гематологических показателей использовали цельную кровь (с гепарином), для биохимических - готовили сыворотку крови. Весь материал статистически обработан по методу Стьюдента-Фишера.

2.2.3.2.1.1. Фармакологические свойства пасты але- зан при остром и хроническом воздействиях

Острая токсичность пасты при введении в желудок

Изучение параметров острой токсичности препарата проводили на 36 белых мышах линии BALB массой 18-20 г. Животных перед опытом выдерживали на голодной диете в течение 18-20 часов. Препарат им вводили в желудок с помощью иглы с булавовидным утолщением в дозах: первой группе 1,25 г/кг, второй группе 2,5 г/кг; третьей - 3,75 г/кг; четвертой - 5,0 г/кг; пятой - 6,25 г/кг; шестой- 12,5 г/кг. Кормление животных допускалось только через 3 часа после введения препарата. В течение 2-х недель за животными велось наблюдение - учитывалась клиническая картина интоксикации и смертность животных по дням.

В результате были определены смертельные дозы (LD)6, LD50, LD84, LDioo) препарата. Результаты представлены в табл. 2.35. Как следует из таблицы, LD50 составила - 3,75 г/кг, LDmo - 12,5 г/кг.

Результаты определения острой токсичности антигельминтной пасты алезан

Таблица 2.35.

Дозы в г/кг

1,25

2,5

3,75

5,0

6,25

12,5

Выжило

6

4

3

2

1

0

Погибло

0

2

3

4

5

6

Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат в условиях острого опыта при введении в желудок может быть отнесен к 3 классу опасности (ГОСТ 12.1.007-76).

Клиническая картина интоксикации животных, подвергшихся воздействию препарата в диапазоне доз от 3,75 до 12,5 г/кг, выражалась в виде угнетения, у мышей наблюдались плавательные движения, шерстный покров был влажным, сукровичных выделений не наблюдали. Смерть наступала через 15 - 120 минут.

При проведении патологоанатомического вскрытия этих животных не были отмечены признаки патологии внутренних органов.

Желудок и кишечник были слабого наполнения кашицеобразной консистенции содержимого. На основании полученных данных разработали схему-модель острой токсичности антигельминтной пасты алезан (рис.2.173.)

Изучение кумулятивных свойств пасты алезан

Кумулятивные свойства пасты изучали методом Лима и соавт. (1961) (тест субхроническая токсичность). Опыт проводили на 40 белых мышах-самцах живой массой 19-20 г.

Животные первой группы (30 голов) получали испытуемый препарат, животные второй группы (10 голов) служили контролем и получали воду в том же объеме, что и животные первой группы.

Препарат в виде водной эмульсии вводили животным индивидуально, ежедневно, в желудок при помощи шприца с оливой.

Все животные содержались на стандартном корме, одинаковом для обеих групп. В течение первых 4-х дней животные опытной группы получали препарат в дозе, равной 1/10 ЛД50. Через каждые четыре дня дозу увеличивали в 1,5 раза.

В течение опыта вели наблюдение за животными, отмечали их смертность. Результаты опыта приведены в таблице 2.36. и 2.37.

Изучение кумулятивных свойств препарата

Таблица 2.36.

Периоды введения (суг)

Ежедневно вводимая доза, мг/кг

Суммарная доза препарата, мг/кг

Было/нало

%

гибели

1-4

375

1500

30/0

0

5-8

562,5

2250

30/2

6,6

9-12

843,75

3375

30/5

16,6

13-16

1265,6

5062

30/9

30

17-20

1898,4

7593,6

30/11

36,6

21-24

2847,6

11390,4

30/15

50

25-28

4271,4

17085,6

30/26

86,6

29-31

6406,5

25626

30/30

100

Таблица 2.37.

Параметры токсического действия препарата для мышей при введении в желудок

Суммарная доза, мг/кг

2250

3375

5062

7593

11390

17085

25626

Г ибель

0/30

2/30

5/30

11/30

15/30

26/30

30/30

Z

1

3,5

7

10

13

22,5

d

1125

1687

2531

3796

5695

8542,1

Zd

1125

5904

17717

37960

74035

192195

Определение ЛД5о= ЛДюо -1 Zd : п

Используя формулу Кагана-Станкевича, определили коэффициент кумуляции:

Суммарная доза (ЛД50 - многократная), вызвавшая 50 % гибель мышей, равнялась 14662 мг/кг. Разделив эту величину на ЛД50 при однократном введении, получили, что коэффициент кумуляции равен 3,9. По классификации веществ по кумулятивным свойствам препарат относится к группе веществ со слабо выраженной кумуляцией.

На основании полученных результатов разработали схему- модель кумулятивного действия пасты алезан (рис.2.174.).

Влияние антигельминтной пасты алезан на антитоксическую функцию печени

В опыт по изучению влияния препарата на антитоксическую функцию печени взяли - 70 белых беспородных мышей, массой 18-20 г и разделили их на 3 группы. Контрольных и подопытных животных подбирали парами по весу и гексенал им вводили одновременно. Паста в дозе 1,0 г/кг и 3,0 г/кг по ДВ давали перорально индивидуально с помощью зонда в виде взвеси в 2 %-ном крахмальном клейстере.

Раствор гексенала готовили непосредственно перед применением и вводили внутрибрюшинно в дозе 1,0 и 2,0 мг/кг массы тела через 1, 3 и 24 часа после дачи препарата.

Скорость наступления и длительности гексеналового сна отсчитывали с момента принятия «бокового положения» до первых попыток изменить его и выражали в минутах.

Результаты исследований функционального состояния печени представлены в табл. 2.38.

Таблица 2.38.

Г руина

Количество животных в группе

Доза препарата г/кг но ДВ

Время сна мышей, мин

1 час

10

22,4±0,22

Опытная

3 часа

10

1,0

22,6±0,30

24 часа

10

23,1±0,20

1 час

10

26,9±0,35

Опытная

3 часа

10

3,0

24,6±0,25

24 часа

10

24,2±0,75

Контроль

10

21,8

Как показали исследования, препарат в испытуемых дозах достоверного увеличения времени сна у мышей не вызывал. Следовательно, паста не обладает гепатотропным действием и не приводит к нарушению функционального состояния печени.

Местное и кожно-резорбтивное действие антигельминтной пасты алезан

С этой целью провели опыт на 6 кроликах, которым за сутки до начала опыта выстригали шерсть в области спины площадью 3x4 см .

Пасту в дозе 3,75 г/кг на твине наносили на подготовленную поверхность и слегка втирали. Животных помещали в обычные клетки и кормили, согласно зоотехническим нормам.

В течение 30 суток после начала опыта вели визуальное наблюдение за внешним видом, состоянием и поведением животных.

Отмечали время, степень проявления признаков токсикоза, а также падеж животных.

Реакцию кожи учитывали по шкале оценки кожных проб (С.В. Суворов, 1974).

В результате экспериментов, проведенных по стандартным методикам, было показано, что однократная аппликация пасты на кожу кроликов в дозе 3,75 мг/кг в течение 4 часов не вызывала изменений в состоянии животных. Не выявлено гибели животных во всех группах, что свидетельствует об отсутствии кожно-резорбтивного действия препарата при его однократном применении.

Кожно-резорбтивное действие изучали на 5 крысах. Трех крыс фиксировали в специальных домиках, а их хвосты погружали на 2/3 длины в пробирки с препаратом, приготовленном на твине в соотношении 1:10. Время экспозиции - 4 часа в течение 5 дней. Хвосты двух контрольных крыс погружали на 2/3 длины в пробирки с тви- ном.

Как показали исследования, опытные крысы на протяжении эксперимента практически не отличались от контрольных.

Наблюдение в течение двух недель после нанесения препарата не выявило каких-либо проявлений интоксикации, кожа покрывалась равномерным гладким шерстным покровом, животные были подвижны и хорошо поедали корм.

Следовательно, препарат не вызывал местного и кожно- резорбтивного действия при однократном нанесении на кожу в дозе 3,75 г/кг и относится к 4 классу опасности.

Токсические свойства антигельминтной пасты алезан в хронических опытах

Изучение проведено в опытах на 18 белых беспородных крысах- самцах с исходной массой 150 - 160 г. Животным в желудок ежедневно в течение 14 дней через желудочный зонд вводили пасту в виде суспензии на крахмальном клейстере в дозах 1/10 и 1/100 от ЛД50, что соответствовало 375 мг/кг и 37,5 мг/кг. Каждая подопытная и контрольная группы состояли из 6 животных. Животным контрольной группы, при тех же условиях содержания и кормления, вводили равный объем крахмального клейстера.

Признаков токсикоза и гибели животных, не наблюдали, что указывает на отсутствие у препарата эффекта кумуляции по токсическому признаку.

Обследование животных, получавших в течение 14 дней пасту в дозе 3,75 мг/кг и 37,5 мг/кг от ЛД50 с использованием клиникобиохимических методов, не показало статистически значимых отличий опытных и контрольных групп.

Анализы проводили на 14-й день опыта после декапитации животных.

Оказалось, что препарат не влиял на прирост массы тела животных (табл. 2.39.).

Таблица 2.39.

Динамика прироста массы тела крыс при ежедневном введении антигельминтной пасты алезан в желудок в течение 14 дней

Сроки

взвешивании

Масса тела крыс, г

контроль

ОД ЛД5()

0,01 ЛД50

0

152,2±1,8

155,1±0,9

150,2±0,4

1 неделя

160,2±1,4

160,2±1,2

155,4±0,6

2 недели

172,2±1,2

165,2±0,8

161,2±0,3

Примечание'. Р > 0,05

Установили, что гематологические показатели крыс, получавших пасту, не отличались от таких же показателей у животных контрольной группы (Р>0,05, табл. 2.40.).

Гематологические показатели крыс на фоне ежедневного введения антигельминтной пасты алезан

Таблица 2.40.

Группы

животных

Количество

животных

Гемоглобин

г, %

Эритроциты

1012/л)

Лейкоциты

109/л)

Контрольная

6

12,5±0,1

8,1±0,3

12,8±0,3

Опытная

0,1 лд50

6

12,6±0,4

8,0±0,2

12,4±0,2

Опытная

0,01 лд50

6

12,1±0,3

8,3±0,4

12,6±0,7

Биохимические показатели животных изучали также после введения пасты в дозе 0,1 и 0,01 ЛД50.

Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатамино- трансферазы (АсАТ) определяли по Райтману и Френселю, общий белок по Лоурн, щелочную фосфатазу по Боданскому (табл. 2.41.)

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии разницы в показателях крови крыс разных групп (Р>0,05).

Таблица 2.41.

Биохимические показатели крови крыс на фоне длительного введения им антигельминтной пасты алезан

Г руины

ЖИВОТНЫХ

Число

жив-х

АлАТ,

ммоль/час

АсАТ,

ммоль/час

Щелочная

фосфатаза

ед.бод.

Белок

г/л

Контрольная

6

0,68±0,03

0,81±0,01

28,4±0,9

69,5±1,2

Опытная 0,1 ЛД50

6

0,70±0,02

0,80±0,02

25,6±1,2

69,0±1,4

Опытная 0,01 ЛД50

6

0,71±0,02

0,81±0,01

28,2±1,2

69,4±1,4

На основании полученных результатов исследований разработали схему-модель влияния антигельминтной пасты алезан на биохимические показатели гомеостаза животных (рис. 2.175.).

Функциональное состояние почек после продолжительного введения препарата в дозах 0,1 и 0,01 ЛД50 оценивали по показателям суточного диуреза, содержанию белка и мочевины. Мочу собирали в течение 24 часов в метаболические камеры при нормальной водной нагрузке. Определение мочевины и белка проводили общепринятыми методами.

Установили, что препарат не оказывал выраженного отрицательного влияния на функциональное состояние почек подопытных животных (табл. 2.42.).

Таблица 2.42.

Влияние длительного применения антигельминтной пасты алезан на функциональное состояние почек крыс (введение в течение 14 дней)

Г руины животных

Число

животных

Суточный диурез, мл/суг

Мочевина,

мг, %

Белок,

мг/мл

Контрольная

6

6,8±0,25

23,8±1,2

6,0±0,3

Опытная 0,1 ЛД5()

6

6,6±0,22

24,2±0,9

6,4±0,2

Опытная 0,01 ЛД50

6

6,8±0,11

24,0±1,1

6,2±0,2

Построением линейно-графической модели подтвердили результаты наших исследований (рис. 2.176.)

По окончании эксперимента были декапитированы все животные и определена масса органов от животных всех групп. При этом не установлено существенного различия в массе органов крыс подопытных и контрольных групп, что указывает на отсутствие отрицательного влияния пасты на массу внутренних органов при длительном его применении.

Для макро- и микропатоморфологических исследований брали небольшие кусочки различных органов крыс, фиксировали в 10 %-ном формалине с последующим проведением через батарею спиртов восходящей крепости.

Приготовленные по общепринятым методикам образцы тканей легких, сердца, селезенки, тонкого и толстого кишечника, окрашивали гематоксилином, а ткани мозга окрашивали по Нильсону.

Структура внутренних органов при макроскопическом исследовании у крыс подопытных и контрольной групп не отличалась. (Подробное изложение результатов гистоисследований в специальном разделе). При гистологическом исследовании тканей и органов крыс подопытной группы, получавших препарат в дозе 0,1 ЛД50, были установлены изменения: в печени - умеренная дистрофия гепатоцитов, в почках - полнокровие сосудов стромы и капилляров клубочков, зернистая дистрофия эпителия извитых канальцев. В тканях других органов изменений не установлено.

Таким образом, дозу 0,1 ЛД50 можно считать за пороговую, а дозу 0,01 ЛД50 - за недействующую.

2.2.3.2.1.2. Влияние антигельминтной пасты алезан на организм лошадей

С этой целью опыты проводили в ЗАО «Московский конный завод №1» Одинцовского района Московской области.

На 15-ти лошадях 3-5-летнего возраста, по принципу аналогов разделенных на 3 группы. Животным 1-й и 2-й подопытных групп пасту вводили перорально в терапевтической, в три раза увеличенной дозах, соответственно 1 г/100 кг и 3 г/100 кг. Животные 3-й группы препарат не получали и служили контролем.

В течение опыта всех животных содержали в одинаковых условиях. Клинические, биохимические и гематологические исследования по контролю за состоянием животных проводили за сутки до и через 1, 5 и 10 суток после презентации препарата по общепринятым методикам.

Клинические исследования и отбор проб крови проводили в одно и то же время - в 6 часов утра, т. е. до кормления животных.

Установили, что температура тела у лошадей подопытных и контрольной группы варьировала в пределах 37,8 - 38,2°С, пульс - 32 - 38 ударов в минуту, дыхание 10- 12 вдохов в минуту. Полученные результаты свидетельствуют о том, что показатели клинического состояния животных подопытных групп, получавших антигельминтную пасту в дозах 1 г/100 кг и 3 г/100 кг, были в пределах физиологической нормы лошадей и существенно не отличались от их исходного клинического состояния и от состояния животных контрольной группы (табл. 2.43.).

Количество эритроцитов и лейкоцитов в 1 мкл крови, содержании гемоглобина и показатели лейкоцитарной формулы лошадей 1 и 2- й групп в течение всего периода исследований были в пределах физиологической нормы и существенно не отличались от показателей животных контрольной группы.

Удельный вес мочи и показатель pH мочи животных 1 и 2 подопытных групп, получавших антигельминтную пасту, не изменялись после введения препарата и находились в пределах физиологической нормы, не отличалась от аналогичных показателей животных контрольной группы.

Все исследуемые показатели общего состояния, крови и мочи у животных контрольной и подопытной групп в течение всего опыта были на одном уровне и существенно не менялись (табл. 2.43.-2.44.).

При исследовании биохимических показателей крови нами не установлено достоверной разницы+ во всех исследуемых показателях у животных контрольной и подопытных групп (табл. 2.45.).

Таким образом, антигельминтная паста алезан в терапевтической (10 мг/кг) и в 3 раза увеличенной (30 мг/кг) дозе не оказывает отрицательного влияния на клиническое состояние лошадей, гематологические и биохимические показатели и физико-химические свойства мочи.

2.2.3.2.1.3. Изучение аллергенных свойств антигельминтного препарата алезан

Изучение аллергенных свойств препарата проводили по 2 тестам: конъюнктивальной пробой и РДТК.

При нанесении одной капли раствора пасты в дозе 10 мг по ДВ опытным животным в верхнее веко правого глаза, а контрольным- вазелин в верхнее веко левого глаза, через 15 минут отмечали покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице (2 балла), через 24 часа реакция отсутствовала (табл. 2.46.).

Динамика гематологических показателей организма лошадей после введения им антигельминтной пасты алезан

Таблица 2.43.

№ гр.

Доза нрепара- та

Результаты исследований

До обработки

Че|

эез 1 сутки

Через 5 суток

Через 10 суток

гемогл.

г/л

эрит.

1012

лей к. 109

гемогл.

г/л

эрит.

1012

лейк.

109

гемогл.

г/л

эрит.

1012

лейк.

109

гемогл.

г/л

эрит.1

0|2

лейк.

109

1

под-

опыт-

ные

10 мг/кг

12,2±1,4

8,4+0,8

7,8+0,6

12,4±1,2

8,2+0,6

8,0+0,4

12,2+1,4

8,2+0,4

8,2+0,2

12,8+0,9

7,8+0,9

8,0+0,3

В % к контролю

95,4

102,4

92,2

101,6

97,6

100

96,8

102,5

105,0

103,2

95,1

95,2

2

30 мг/кг

11,8±1,8

8,0+0,3

8,0+0,4

12,0±1,8

8,0+0,4

8,2+0,6

12,4+1,6

8,6+0,5

8,0+0,2

12,3+0,7

8,0+0,3

8,1+0,5

В % к контролю

95,2

97,6

95,2

98,4

95,2

102,5

98,4

107,5

97,6

99,2

97,6

96,4

3

контроль

Не получали

12,4±1,2

8,2+0,9

8,4+0,7

12,2±1,6

8, 4+0,6

8,0+0,4

12,6+1,8

8,0+0,6

8,2+0,4

12,4+1,2

8,2+0,9

8,4+0,2

Таблица 2.44.

Динамика биохимических показателей мочи лошадей после введения им препарата алезан

Доза препарата

Результаты исследований

гр.

До обработки

Через 1 сутки

Через 5 суток

Через 10 суток

Удельный

вес

Показатель pH

Удельный

вес

Показатель pH

Удельный

вес

Показатель pH

Удельный

вес

Показатель pH

1.

10 мг/кг

1,040±0,04

7,2±0,8

1,038±0,07

7,4±0,7

1,034±0,08

7,8±0,9

1,032±0,07

7,5±0,4

В % к контрою

101,0

100,0

100,8

102,8

100,2

105,4

100,0

102,7

2.

30 мг/кг

1,025±0,06

7,4±0,6

1,034±0,06

7,4±0,8

1,038±0,07

7,6±0,3

1,034±0,06

7,4±0,2

В % к контролю

99,5

102,3

100,4

102,8

100,6

102,7

100,2

101,4

3.

Контроль

1,030±0,06

7,2±0,4

1,030±0,06

7,2±0,6

1,032±0,04

7,4±0,6

1,032±0,02

7,3±0,4

Таблица 2.45.

Биохимические показатели сыворотки крови лошадей после введения антигельминтной пасты

Наименование

показателей

Группы животных

до обработки

через сутки

через 5 суток

че

рез 10 суток

1

2

3

конт

роль

1

2

3

конт

роль

1

2

3

конт

роль

1

2

3

конт

роль

Общий белок, г/100 мл

6,6±0,2

6,4±0,3

6,8±0,4

6,6±0,3

6,0±0,1

6,4±0,3

6,5±0,2

6,2 ±0,1

6,4±0,3

6,4±0,5

6,4±0,7

6,2±0,4

Альбумины, %

36,8±1,2

39,4±0,8

37,2±0,9

36,8±0,8

37,4±0,7

38,8±1,2

36,6±0,4

37,9±0,4

39,2±1,4

36,8± 1,4

38,2±0,9

39,8±1,2

Альфа- глобулины, %

14,6±0,8

15,2±1,2

16,4±0,4

14,8±0,4

15,6±0,9

16,8±0,2

15,0±0,9

15,8±0,7

15,4±0,8

14,8±0,2

15,2±0,7

15,0±0,4

Бета-глобулины,

%

22,4±1,2

24,4±1,4

26,2±0,9

24,4±1,2

24,3±1,2

24,8±1,0

22,8±0,9

25,0±0,8

25,2±0,8

24,8±1,2

24,4±0,9

25,2±1,4

Гамма- глобулины, %

26,6±1,8

21,0±0,8

20,2±0,7

24,0±1,3

22,7±1,8

19,6±0,7

25,6±0,8

21,3±1,5

20,2±0,4

23,6± 1,6

22,2± 1,7

20,0±1,2

Сахар, ммоль/л

4,8±0,4

5,0±0,7

4,7±0,4

4,8±0,5

4,9±0,2

4,4±0,6

4,6±0,2

4,4±0,4

4,6±0,2

4,6±0,7

4,2±0,6

4,4±0,8

Биллирубин,

мкмоль/л

14,2±0,8

14,0±0,2

14,4±0,8

14,4 ±0,7

14,6±0,8

15,0±0,7

14,2±0,6

14,8±0,4

14,4±0,8

14,2±0,4

14,2±0,6

14,6±0,8

Холестерин,

ммоль/л

1,6±0,02

1,58±0,04

1,62±0,05

1,67±0,04

1,64±0,03

1,69±0,05

1,67±0,08

1,64±0,07

1,54±0,04

1,62±0,08

1,56±0,02

1,60±0,04

Таблица 2.46.

Результаты конъюнктивальной пробы

№ животного

Название препарата

Результаты реакции, через:

15 минут

24 часа

48 часов

1.

Паста антигельминтная

  • 1
  • 2+
  • 3

2.

Паста антигельминтная

  • 1 +
  • 2
  • 3

3.

Паста антигельминтная

  • 1
  • 2+
  • 3

4.

Контроль (вазелин)

  • 1
  • 2+
  • 3

5.

Контроль (вазелин)

  • 1
  • 2+
  • 3

Примечание:

  • 1 - легкое покраснение слезного протока (1 балл);
  • 2 - покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице (2 балла);
  • 3 - покраснение всей конъюнктивы и склеры (зуд) (3 балла).

При введении контрольным животным в левое веко отмечали

легкое покраснение слезного протока, через 15 минут реакция исчезла (1 балл). При промывании глаз водой указанные признаки исчезали через 3-4 часа.

Изучение аллергенных свойств препарата путем постановки реакции дегрануляции тучных клеток

Реакции дегрануляции тучных клеток провели на 6 мышах линии СВА, которым задавали антигельминтную пасту, разведенную в крахмальном клейстере 1:10, в дозе 10мг/кг по ДВ. Через 2 дня мышей убили, собрали сыворотку крови. Тучные клетки выделяли из перитонеальной жидкости 2 крыс-самцов массой 150- 180 г после внутри- брюшинного введения физраствора с гепарином в количестве 10 мл.

На предметные стекла, покрытые 0,3 % нейтральротом на абсолютном спирте, наносили по 1 капле тучных клеток, сыворотку крови от подопытных мышей и препарат в разведении 1:10. В контрольную пробу брали тучные клетки и сыворотку крови от тех же мышей (по 1 капле) и по разнице процента дегрануляции тучных клеток в опыте и в контроле судили о сенсибилизации организма. Для контроля достоверности полученных данных подсчитывали процент дегрануляции тучных клеток в перитонеальной жидкости (10 %) и с комплементом (8 %) (табл.2.47.).

Результаты реакции дегрануляции тучных клеток на введение пасты

Таблица 2.47.

№ гр.

Жи

вот

ное

% дегрануляции тучных клеток в опыте

% дегрануляции тучных клеток в контроле

Результаты дегрануляции тучных клеток, %

1

1

26

18

8

2

24

19

5

3

25

19

6

4

27

20

6

5

25

18

7

6

22

16

6

М±т

24,83±1,2

18,33±0,9

6,33±0,4

Примечание: согласно полученным данным, процент дегрануляции тучных клеток составил 6,33±0,4, а при дегрануляции тучных клеток в размере до 10 % следует, что препарат не обладает сенсибилизирующими свойствами.

На основании полученных результатов исследований разработали линейно-графическую модель дегрануляции тучных клеток под воздействием антигельминтной пасты (рис. 2.177.)

2.2.3.2.1.4. Изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств антигельминтной пасты алезан

Проведено в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств», утвержденными Минздравом РФ, 1986 г.

Опыты по определению возможного эмбриотоксического действия данной пасты проводили на 48 беременных самках белых крыс массой 220 - 250 гиб самцах. К самкам, в стадии эструса и проэстру- са, на ночь подсаживали самцов из расчета один самец на четыре самки. Обнаружение спермиев во влагалищном мазке на следующее утро считали первым днем беременности.

Испытывали терапевтическую и трехкратно увеличенные дозы

пасты.

В каждой группе было по 6 животных с соответствующим числом в контроле, которым препарат не вводили. Пасту вводили в желудок крысам первой группы с 1 по 6 дни беременности, второй группе - с 7 по 13 дни и третьей группе - с 14 по 19 дни.

На 20-й день беременности самок декапитировали, подсчитывали количество желтых тел беременности в яичниках и мест имплантации.

Для определения эмбрионального действия пасты учитывали предимплантационную гибель зигот (разность между количеством желтых тел беременности в яичниках и количеством мест имплантации в матке от общего числа желтых тел), постимплантационную гибель эмбрионов (разность между количеством мест имплантации и количеством живых плодов в матке от числа мест имплантации) и общую эмбриональную смертность (разность между числом желтых тел беременности и живыми плодами в процентах от числа желтых тел в яичниках).

Результаты опыта были статистически обработаны методом Стъюдента-Фишера.

Полученные данные исследований сведены в табл.2.48., из которых следует, что паста в терапевтической дозе не проявила эмбрио- тропной активности: предимплантационная гибель зигот варьировала от 4,28 ± 0,24 - 4,40 ± 0,20 в подопытных и 4,30 ± 0,22 в контрольной группе; постимплантационная гибель эмбрионов соответственно 4,14 ± 0,19 - 4,28 ± 0,12 и 4,22 ±0,14; а общая эмбриональная смертность - от 8,25 ± 1,12 - 9,03 ± 1,28 и 8,25 ± 1,27, соответственно.

Показателями тератогенного действия являются нарушения органогенеза во внутриутробном периоде и изменения костной системы плода. Так, при измерении костной системы плодов установлено, что длина трубчатых костей была почти одинаковой (табл.2.49.; Р>0,05). Не выявлено случаев уродств и изменений внутренних органов при исследовании плодов. Данные, полученные при визуальном осмотре и измерении плодов в опытных и контрольных группах, также подтвердили отсутствие отрицательного действия, у животных подопытных групп масса плодов была 2,58±0,04 - 2,60±0,06 и 2,56±0,04; масса плаценты - 0,54±0,03 - 0,55±0,02 и 0,54±0,02 г. Соотношение женских и мужских особей в помете находилось в близких, практически одинаковых пределах.

Таблица 2.48.

Результаты изучения эмбрионального материала, полученного от крыс после введения им суспензии антигельминтной пасты алезан в терапевтической дозе в желудок в разные периоды беременности

Дни беременности

Кон-

Показатели

1-6

7-13

14-19

трольнан

группа

Количество самок

6

6

6

6

Масса эмбрионов, г

2,58±0,04

2,56±0,02

2,60±0,06

2,56±0,04

Размер эмбрионов, мм

3,02±0,06

3,04±0,03

3,05±0,04

3,03±0,09

Масса плаценты, г

0,54±0,03

0,55±0,02

0,53±0,01

0,54±0,02

Диаметр плаценты, см

1,48±0,02

1,47±0,05

1,48±0,04

1,46±0,03

Количество эмбрионов

10,3±0,34

10,2±0,25

10,2±0,45

10,3±0,34

Общая эмбриональная смертность, %

8,25±1,12

9,03±1,28

8,68±1,14

8,25±1,27

Предимплантационная смертность, %

4,28±0,24

4,38±0,15

4,40±0,20

4,30±0,22

Постимплантационная смертность, %

4,14±0,19

4,19±0,12

4,28±0,12

4,22±0,14

Число случаев полной внутриутробной гибели

нет

нет

нет

нет

Число самцов/самок в помете

47,14/52,86

48,20/51,80

48,24/51,76

48,88/51,12

Число плодов с аномалиями

нет

нет

нет

нет

Примечание'. Р>0,05.

Таблица 2.49.

Средние размеры зачатков костной системы плодов от крыс, получавших антигельминтную пасту алезан в терапевтической дозе

Размер костей, мм

Наименование костей

Группы животных:

опытные М±ш

контрольные М±ш

лопаточная

левая

правая

  • 2,35±0,02
  • 2,36±0,04
  • 2,35±0,02
  • 2,34±0,04

плечевая

левая

правая

  • 2,56±0,02
  • 2,57±0,04
  • 2,57±0,02
  • 2,58±0,02

локтевая

левая

правая

  • 2,68±0,03
  • 2,69±0,04
  • 2,70±0,02
  • 2,69±0,04

лучевая

левая

правая

  • 2,01±0,03
  • 2,01±0,04

2,01 ±0,02 2,02±0,03

бедренная

левая

1,76±0,02

1,77±0,02

правая

1,77±0,04

1,76±0,04

б. берцовая

левая

правая

  • 2,09±0,04
  • 2,08±0,05
  • 2,10±0,03
  • 2,09±0,02

м. берцовая

левая

правая

  • 1,96±0,03
  • 1,95±0,02

40 40 04 Ui

н- н-

о о о о

< J -1^

Примечание'. Р>0,05.

На основании результатов исследований следует, что антигельминтная паста алезан, введенная в терапевтической дозе беременным крысам на 1-6, 7 — 13 и 14 — 19 днях беременности, не оказала тератогенного и эмбриотоксического воздействия.

Результаты изучения эмбрионального материала, полученного от крыс после введения пасты в 3 раза увеличенной дозе - 30 мг/кг в разные периоды беременности, представленные в табл.2.50., 2.51., также указывают на отсутствие изменений в развитии эмбрионов (Р>0,05).

Таблица 2.50.

Дни беременности

Контрольная

труппа

Показатели

1-6

7-13

14-19

Количество самок

6

6

6

6

Масса эмбрионов, г

2,53±0,06

2,54±0,02

2,53±0,06

2,55±0,07

Размер эмбрионов, мм

2,99±0,04

з,оо±о,оз

3,01±0,04

3,01±0,06

Масса плаценты, г

0,53±0,05

0,54±0,02

0,53±0,02

0,53±0,06

Диаметр плаценты, см

1,49±0,04

1,48±0,05

1,51±0,04

1,49±0,02

Количество эмбрионов

10,2±0,24

10,1±0,28

10,3±0,38

10,2±0,66

Общая эмбриональная смертность, %

8,55±1,48

9,02±1,36

8,90±1,25

8,38±1,23

Предимплантационная смертность, %

4,51±0,45

4,52±0,42

4,43±0,28

4,26±0,34

Постимплантационная смертность, %

4,48±0,24

4,34±0,32

4,28±0,30

4,30±0,42

Число случаев полной внутриутробной гибели

нет

нет

нет

нет

Число самцов/самок в помете

48,86/51,14

48,98/51,02

49,26/50,74

48,52/51,48

Число плодов с аномалиями

нет

нет

нет

нет

Примечание'. Р>0,05.

Таблица 2.51.

Средние размеры зачатков костной системы плодов крыс, получавших антигельминтную пасту алезаи в 3 раза увеличенной дозе

Наименование костей

Размер костей, мм

Группы животных:

опытные М±ш

контрольные М±ш

лопаточная

левая

правая

  • 2,35±0,03
  • 2,36±0,04
  • 2,36±0,03
  • 2,35±0,05

плечевая

левая

правая

  • 2,54±0,04
  • 2,55±0,06
  • 2,53±0,02
  • 2,54±0,06

локтевая

левая

правая

  • 2,69±0,02
  • 2,70±0,03
  • 2,70±0,04
  • 2,71±0,05

лучевая

левая

правая

  • 2,01±0,03
  • 2,02±0,04
  • 2,01±0,05
  • 2,01±0,04

бедренная

левая

правая

  • 1,76±0,03
  • 1,77±0,05
  • 1,77±0,05
  • 1,75±0,03

б. берцовая

левая

правая

2,10±0,05 2,11±0,05

2,11±0,07 2,10±0,07

м. берцовая

левая

правая

  • 1,96±0,04
  • 1,96±0,05
  • 1,95±0,05
  • 1,96±0,04

Примечание'. Р>0,05.

Результаты изучения эмбрионального материала, полученного от крыс после введения антигельминтной пасты алезаи в 3 раза увеличенной дозе внутрижелудочно однократно с 1-6, 7 — 13 и 14 — 19 дни беременности.

Изучение цитогенетической активности антигельминтной пасты алезаи

Проводили на 36 молодых крысах-самцах массой 120 - 150 г и на 36 взрослых крысах-самцах и самках массой 180-220 г двумя методами: метафазным анализом клеток костного мозга (соматические клетки) и микроядерным методом доминантных летальных мутаций (половые клетки). Метафазный метод заключается в том, что за 2-

2,5 часа до убоя животным внутрибрюшинно вводили колхицин в форме 0,04%-ного раствора. Вымытый в пробирку костный мозг ресуспендировали пастеровской пипеткой и оставляли в термостате при 37°С на 6-7 мин. Далее центрифугировали 5 мин при 1000

об/мин. Надосадочную жидкость осторожно сливали и заменяли фиксатором, состоящим из смеси метилового спирта и ледяной уксусной кислоты. Фиксатор меняли дважды. Пробирки помещали в холодильник на 30 мин, после чего суспензию клеток наносили на предметное стекло. Окраску проводили по Романовскому. Статистическую обработку результатов обоих методов проводили по Стьюденту-Фишеру с использованием таблиц для ускоренной оценки фармакологического эффекта.

Исходя из того, что паста с лечебной целью животным вводится однократно, мы использовали дозу равную 1/2 от ЛД50, перорально и фиксировали клетки через 6, 24, 48 часов и 5, 7 и 10 суток соответственно срокам выведения препарата и возможных отдаленных последствий.

Полученные результаты, представленные в табл.2.52., свидетельствуют о том, что паста не вызывает достоверного повышения частоты аберраций по сравнению с контролем. Анализ структурных нарушений хромосом показал, что препарат вызывал образование одиночных фрагментов, причем их уровень не превышал нарушения клеток в контроле (Р<0,05).

Установили, что паста не оказывала мутагенного эффекта в клетках костного мозга соответственно срокам фиксации клеток и ее выделения из организма животного (до 5 суток) после введения препарата.

Препарат при фиксации метафаз через 6 часов вызывал 2,46±0,04 % поврежденных клеток, в контроле - 2,44±0,04 % (Р<0,05). Уровень аберрантных клеток при фиксации через 24 часа после введения был равен 2,44±0,02 % и через 48 часов 2,43±0,04 % (Р<0,05).

Таблица 2.52.

Результаты изучения цитогенетической активности препарата (антигельминтной пасты алезан по метафазному тесту клеток

костного мозга)

Экспозиции

Процент метафазных клеток с нарушениями, в %

опыт

Контроль

Часы

6

2,46±0,04

2,44±0,04

24

2,44±0,02

2,46±0,03

48

2,43±0,04

2,43±0,06

сутки

5

1,38±0,02

1,37±0,04

7

1,37±0,03

1,36±0,05

10

1,36±0,02

1,36±0,03

Все это дает основание для заключения о том, что антигельминтная паста алезан не вызывает достоверного повышения частоты аберрантных метафаз по сравнению с контролем.

Не было установлено корреляционной зависимости между цитогенетической активностью препарата и уровнем его содержания в крови. Препарат не влиял на митогенез как в ранние, так и в более поздние сроки после его введения.

Уровень аберрантных метафаз в разные сроки после обработки пастой не изменялся. Микроядерный тест показал ту же закономерность.

Процент клеток с микроядрами (ретикулоциты) в опыте и контроле был близким (Р<0,05; табл. 2.53.).

Результаты изучения цитогенетической активности

антигельминтной пасты алезан по микроядерному тесту (в клетках костного мозга) Р

Таблица 2.53.

Экспозиции

Процент ретикулоцитов с микроядрами

опыт

контроль

Часы

6

1,60±0,04

1,62±0,03

24

1,62±0,03

1,61 ±0,02

48

1,61 ±0,01

1,59±0,03

сутки

5

1,66±0,02

1,62±0,03

7

1,53±0,02

1,51±0,03

10

1,33±0,02

1,31 ±0,02

При фиксации клеток через 6 часов этот показатель составил 1,60 ± 0,04 %. При фиксации клеток через 48 часов процент клеток с микроядрами составил 1,61 ±0,11, при 1,59 ± 0,03 (Р<0,05) в контроле. Через 5, 7 и 10 суток после обработки препаратом количество микроядер незначительно отличалось от контроля (Р<0,05), что указывает на отсутствие отдаленных последствий действия препарата на митогенез крыс.

На основании полученных результатов исследований следует заключить, что антигельминтная паста в опытах на крысах не проявила цитогенетической активности в двух основных тестах- метафазном анализе клеток костного мозга и микроядерном тесте при исследовании в различные временные периоды после ее презентации и в более поздние сроки (до 10 суток) после введения препарата.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >