Уреаза как регулятор азотистого баланса Helicobacter pylori
Синтез белка Helicobacter pylori требует присутствия постоянного источника азота, без которого жизнедеятельность бактерий попросту невозможна. Уреаза Helicobacter pylori, являющаяся поставщиком большого количества аммиака, обеспечивает микроорганизмы азотом. Эта реакция катализируется другим ферментом микроорганизма глю- таминсинтетазой. Благодаря этим процессам NH3 инкорпорируется в аминокислоты, а затем превращается в белок (за счет реакции аммиака с глютаматом с образованием глютамина). Возможно, что эволюцион- но обусловленная ключевая роль уреазы связана именно с обменнометаболическими процессами, ассоциированными с азотом мочевины [3].
Наряду с обеспечением выживания Helicobacter pylori и колонизации желудка, продукты жизнедеятельности уреазы обладают прямым воздействием на эпителиальные тканевые структуры хозяина.
Уреаза и её продукты как токсиканты и факторы агрессии
В настоящее время доказано, что между просветом желудка и поверхностью клеток покровно-ямочного эпителия существует градиент pH, реализующийся в слое слизи и обусловленный секрецией бикарбонатов в эпителиоцитах слизистой оболочки желудка, которая обеспечивает на поверхности клеток оптимальный pH. Именно этот градиент препятствует повреждению клеток ионами Н+, поскольку слизистый гель замедляет скорость обратной диффузии ионов водорода и за это время бикарбонат ион успевает нейтрализовать Н+-ионы, формируя так называемый «слизисто-бикарбонатный барьер» [3, 13]. Базальная секреция бикарбонатов составляет 5-10% от скорости секреции НС1 и возрастает при снижении pH. Гликопротеиновые компоненты слизи, формирующие защитный барьер слизистой облочки желудка, представляют собой высокомолекулярные гликопротеиновые комплексы (молекулярный вес 2x106), «сшитые» протеиновыми мостиками, которые, в свою очередь, инкорпорированы с липидами в очень большие сферические мицеллы [52], которые образуют непрерывный слой, резистентный к протеолизу и защищают эпителий желудка от действия пептических факторов. Сульфидные связи между субъединицами слизистого покрытия разрушаются пепсином желудочного содержимого до гликопротеиновых мономеров или растворимой слизи, не способной к образованию геля. В связи с этим постоянная секреция слизь- продуцирующих клеток антрума восполняет расход геля с поверхности. Существенную роль играет тот факт, что она покрыта гидрофобными фосфолипидами [13]. Пристеночный защитный слой содержит также мочевину. Мочевина поступает в пристеночный слой желудочного содержимого путем транссудации из плазмы крови, концентрируясь вблизи межклеточных промежутков [28, 53]. На первоначальном этапе колонизации Helicobacter pylori, наряду с преодолением барьерных функций кислоты желудочного сока, вынужден для достижения адгезии к эпителиоцитам преодолевать и слизисто-бикарбонатный барьер желудка. В своих работах [52] группа авторов из Великобритании указала на то, что пропорция гликопротеинов с высоким молекулярным весом в стабильных структурах слизи была значительно снижена у больных с язвенной болезнью желудка на фоне хронического гастрита, связанного с Helicobacter pylori, что позволило им рассматривать эти структурные изменения как этиологический фактор язвенной болезни. А ввиду того, что корреляция между выработкой пепсина (а также НС1 и рефлюксом желчи) и этими изменениями отсутствовала, ученые сделали вывод о том, что этот феномен связан либо с дефектом биосинтеза, либо с разрушением слизистого барьера. R.L. Sidebotham et al. [53] высказали предположение о том, что муколитический эффект мог быть обусловлен карбонатом аммония, сформированным за счет гидролиза мочевины, инкорпорированной в элюанте при фракционировании фильтрата Helicobacter pylori. Экспериментальное исследование уреазы бобов jack bean в присутствии мочевины полностью подтвердило это предположение. Авторы выделили высокомолекулярные протеины желудочной слизи из содержимого желудка здоровых волонтеров и установили, что эти структуры подверглись значительному разрушению при инкубации с фильтратом Helicobacter pylori с выраженной уреазной активностью в присутствии мочевины с образованием фрагментов с молекулярным весом 2x106. Более того, авторам удалось доказать, что утрата желудочным муцином высокомолекулярных частиц гликопротеина является результатом дестабилизирующего воздействия карбонат-бикарбонатного буфера, генерируемого на поверхности слизистой оболочки в тот момент, когда уреаза гидролизует мочевину транссудированную в желудок из плазмы крови. Таким образом, авторы описывают 2 основных механизма, по их мнению, снижающих барьерную функцию слизи желудка: 1) ускорение жизненного цикла и «оборота» (turnover) эпителиальных клеток в присутствии Helicobacter pylori, вследствие чего эпителиоцитам «просто не хватает времени» для биосинтеза слизи; 2) высокомолекулярные структуры «демонтируются» образованием аммониино-карбонатного буфера вследствие уреазного гидролиза, и истощенная отсутствием высокомолекулярных структур слизь теряет свои гидрофобные свойства и обладает меньшей гидрофобной площадью связей, обусловленных липидами, и таким образом теряет свою прочность и вязкие свойства. Значительную роль в формировании этого патофизиологического феномена некоторые авторы придают способности аммиака, генерированного уреазой Helicobacter pylori, разрушать фосфолипидный монослой в защитном слизистом геле и т.о. истощать гидрофобный барьер слизистой оболочки желудка [33]. Японские исследователи продемонстрировали опосредованное NH3 истощение интрацеллюлярного муцина в антральном отделе желудка [36].
Уреаза Helicobacter pylori гидролизует до 85% мочевины, транс- судированной в желудочное содержимое [31]. Сам по себе NH3 способен оказать разрушающий эффект на межклеточные соединения эпителия слизистой оболочки желудка [41].
Накапливаясь в инфицированной слизи в области межклеточных соединений аммиак разрушает физиологический микроклимат пристеночного слизистого барьера, поддерживающего в норме высокий и вариабельный градиент pH между полостью желудка и поверхностью эпителиальных клеток. Аммиак значительно повышает pH внутри слизистой оболочки, приводя тем самым к повышению пропорций неио- низированного аммиака. Хорошо известно, что только неионизирован- ный аммиак способен проникать через липидные мембраны эпителиальных клеток, причем с повышением pH от 6,6 до 9,0 его проникающая способность увеличивается на 50%. Легко проникнув через мембрану клетки, неионизированный аммиак превращается в NH4+ и ОН, повышая, в свою очередь, интрацеллюлярный и митохондриальный уровень pH и повреждает таким образом митохондриальное и клеточное дыхание и, соответственно, энергетический метаболизм и жизнеспособность клеток. При постановке эксперимента потребление кислорода изолированными клетками и митохондриями ингибируется пропорционально концентрации аммиака. Интересно то, что признаки токсического воздействия аммиака на желудочный эпителий идентичны изменениям, которые ассоциированы с повышением pH среды. Наряду с этим, аммиак истощает альфа-кетоглутарат в цикле трикарбоновых кислот и нарушает синтез ATOP в клетках с аэробным дыханием, приводя к нарушению функции париетальных клеток в кислотопродуцирующем участке слизистой оболочки желудка [36].
S. Hazell и A. Lee [28] выдвинули оригинальную гипотезу, согласно которой NH3 повреждает Na+/K+ АТФазу эпителия желудка, а следовательно, и систему протонного пассажа из желудочных желез в просвет желудка. Это происходит в связи с быстрым гидролизом мочевины уреазой Helicobacter pylori в области межклеточных промежутков, что, в свою очередь, с одной стороны, увеличивает чрезслизистый приток мочевины в полость желудка по градиенту концентрации, а с другой (за счет увеличения pH) - создает поток Na+ в полость желудка, а Н+ ионов вглубь слизистой, формируя феномен их обратной диффузии и деструкцию слизистой оболочки желудка. Кроме того, по мнению других исследователей, защелачивание поверхности слизистой оболочки желудка за счет NH4+ ионов приводит к конкуренции между ними и Н+ ионами за катионный обмен с ионами Na+ и ослабляет «чистый» поток протонов, редуцируя Na+/H+ обмен в слизи желудка. Та же группа авторов подтвердила наличие феномена обратной диффузии ионов водорода (кислоты) из полости желудка к эпителию слизистой оболочки желудка при хеликобактерной инфекции и обосновала ещё один механизм этого явления нейтрализацией в слизи Н+ ионов ионами гидроксила, также представляющими собой результат интрага- стрального гидролиза мочевины. Эти данные получили поддержку других ученых, связавших феномен обратной диффузии с накоплением в слое слизи NH3 и НСО3 анионов.
Экспериментально было установлено, что супернатанты культур Helicobacter pylori в присутствии мочевины вызывают лизис культур клеток линии Vero, причем раствор аммиака в концентрации 1,35 ммоль/л и выше вызывал идентичные клеточные изменения. Авторы также установили, что даже при физиологических значениях pH раствор аммиака в концентрации 2,7 ммоль/л способен вызывать отчетливые цитопатические эффекты. Xu et al. провели подобную серию экспериментов с супернатантом культур Helicobacter pylori и клетками Veto, однако авторы моделировали в системе концентрации мочевины соответствующие физиологическим концентрациям в желудке человека. Клетки через 24 часа подверглись интрацеллюлярной вакуолизации, однако введение ингибитора уреазы (ацетогидроксамовая кислота) редуцировало цитотоксический эффект в 75% случаев. К таким же результатам привели эксперименты с живыми культурами Helicobacter pylori и клетками линий CRL 1739 и НЕР2 [38].
Наряду с вакуолизацией, аммиак индуцирует в клетках слизистой оболочки желудка в эксперименте стаз в микроциркуляторном русле дезинтеграцию клеток поверхностного эпителия и их некроз, а в сочетании с ишемией -тяжелые геморрагические повреждения и уль- церогенный эффект. Клинические исследования при Helicobacter pylori - ассоциированном хроническом гастрите подтвердили результаты экспериментальных работ и продемонстрировали идентичные изменения в сосудистом русле слизистой оболочки желудка [38].
Некоторые авторы для объяснения вакуолизации культур клеток вследствие цитотоксического эффекта супернатантов Helicobacter pylori высказывают мнение о том, что белковый цитотоксин Helicobacter pylori индуцирует внутриклеточную вакуолизацию и что вакуолизированные клетки становятся более чувствительными к кил- лингу вызванному NH3, который потенцирует эффект цитотоксина. Возможно также, что штаммы не способные к продукции цитотоксина проявляют цитотоксические свойства опосредованные продукцией NH3.
Уреазная активность Helicobacter pylori может быть также ответственна за повреждения слизистой оболочки желудка вследствие взаимодействия с иммунной системой.
1.5.1.5. Уреаза Helicobacter pylori и ее роль в патогенезе повреждений
слизистой оболочки, потенцируемых иммунной системой
A. Morris et al. установили, что уреазная активность имеет высокую степень корреляции с гистологическими признаками хронического гастрита. Позднее A. Triebling et al. подтвердили факт корреляции между гистологической выраженностью хронического гастрита у взрослых и уровнем активности уреазы Helicobacter pylori, отметив у больных интенсивную нейтрофильную инфильтрацию слизистой оболочки желудка.
Точка зрения о существовании корреляции между нейтрофиль- ной инфильтрацией слизистой оболочки желудка и уреазной активностью вызвала большие разногласия, так как некоторые исследователи не смогли установить связь между активностью гастрита и уреазной активностью хеликобактеров. Вопрос оставался открытым до 1991 года, когда ученым удалось продемонстрировать ещё один патобиохимический механизм формирования хронического гастрита на фоне пилорического хеликобактериоза [28]. Выяснилось, что хронический «активный» гастрит, характеризующий максимальную степень тяжести воспаления слизистой оболочки при хеликобактериозе и проявляющийся нейтрофильной инфильтрацией, является результатом биохимической реакции между хлорноватистой кислотой (оксидант, продуцируемый миелопероксидазой из фагосом нейтрофилов) и аммиаком с образованием монохлорамина NH2CI (продукт взаимодействия NH3 и хлорноватистой кислоты) и гидроксиламина NH2OH, являющихся сильнейшими цитотоксическими факторами, повреждающими ткань желудка. Цитотоксическая активность возможных метаболитов этого процесса, построенная в порядке убывания, была следующей: моно- хлорамин>натрия гипохлорит>аммония хлорид. Цитотоксичность монохлорамина определяется его высокой липофильностью и низким молекулярным весом.
NH3 способен также индуцировать генерацию супероксиданиона и синглетных кислородных радикалов нейтрофилами («кислородный взрыв») и может способствовать этим возникновению острого гастрита.
Уреаза сама по себе способна выступать в роли активатора клеток моноцитарно-макрофагального ряда, используя механизм, независимый от липополисахаридов Helicobacter pylori. Наряду с этим, уреаза Helicobacter pylori может выступать в качестве хемотаксического фактора для моноцитов и нейтрофилов. В последние годы было установлено, что уреаза играет роль модулятора иммунных воспалительных реакций при пилорическом хеликобактериозе. Так, уреаза Helicobacter pylori индуцирует экспрессию на поверхности моноцитов рецептора интерлейки- на2 и экспрессию интерлейкина8 и фактора некроза опухолей.
Данные, полученные некоторыми учёными, подтвердили связь между уреазной активностью Helicobacter pylori и воспалительными изменениями в слизистой оболочке желудка у детей, инфицированных хеликобактериями. Согласно результатам наших исследований, концентрации метаболитов уреазного гидролиза (в частности NH3) коррелируют с тяжестью желудочного воспаления.
В то же время уреаза Helicobacter pylori оказывает прямой токсический эффект на полиморфно-ядерные нейтрофилы, снижая их функциональную активность и способствуя размножению Helicobacter pylori. Этот эффект опосредуется аммиаком, ингибирующим дегрануляцию нейтрофилов, уменьшающим величину актина цитоскелета, увеличивающим деполимеризацию актина и блокирующим слияние фагосом и лизосом.
Подводя итог всему вышесказанному, очевидно, что уреаза Helicobacter pylori является фактором, обеспечивающим колонизацию желудка и выживание бактерий в организме хозяина. Наряду с этим, продукты метаболизма гидролитических реакций, ассоциированных с уреазой, вызывают тяжелые повреждения слизистой оболочки желудка у пациентов с хеликобактериозом. Длительная персистенция возбудителя вызывает, наряду с воспалением, формирование преканцерозных изменений [28].
1.5.1.6. Уреаза Helicobacter pylori и желудочный канцерогенез
Накопление больших количеств аммиака в слизистой оболочке антрального отдела способствует развитию атрофических процессов. Обычно появлению атрофических изменений в слизистой оболочке желудка предшествует ускорение эпителиальной клеточной миграции. В эксперименте была показана этиологическая роль аммиака в ускорении клеточной эпителиальной миграции и атрофии, слизистой желудка у лабораторных животных. В патогенетической модели канцерогенеза, разработанной Р. Correa, мультифокальный атрофический гастрит рассматривается как потенциально преканцерозное состояние. В случае сочетанного воздействия пищевых нитрозаминов (являющихся наиболее мощными индукторами канцерогенеза) и аммиака у лабораторных животных происходит значительное ускорение клеточной пролиферации с постепенным формированием низкодифференцированных аденокарцином. В то же время было бы трудно представить, чтобы все многообразие патогенетических факторов онкогенеза сводилось к простому механическому воздействию аммиака, без учета роли генетических и других факторов. Это тем более очевидно, поскольку далеко не все пациенты инфицированные Helicobacter pylori, заболевают раком желудка. Однако сбрасывать со счетов роль уреазы как потенциального промотора преканцерозных изменений слизистой оболочки преждевременно.
Роль уреазы Helicobacter pylori на сегодняшний день только начинает изучаться и, несмотря на довольно значительное количество публикаций, она еще до конца не расшифрована. Дальнейшие углубленные исследования в этой области будут весьма желательны для окончательного прояснения механизмов возникновения хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori, особенно в детском возрасте [28].
