Формы отчетов о генотипе ВИЧ и их анализ

Все вопросы, касающиеся технической стороны выполнения генотипического теста на резистентность ВИЧ, в этой книге рассматриваться не будут, потому что она предназначена для врачей. Специалисты лабораторной практики, как правило, проходят интенсивное обучение на курсах, организуемых компаниями - поставщиками тестов и оборудования, и в большинстве своем хорошо владеют методологией; теперь их задача - обучиться работать

рука об руку с клиницистами, расшифровывая полученные в лаборатории результаты.

Итак, когда врач получает из лаборатории результат генотипирования ВИЧ, он видит перед собой только отчет, сформированный, как правило, машинным коммерческим алгоритмом. Для дальнейшей самостоятельной работы по интерпретации с привлечением дополнительных инструментов этого недостаточно, и для этих целей необходимо требовать прислать из лаборатории не только отчет, но и саму последовательность генома ВИЧ, обычно в формате файла ***.fasta. Пока идет пересылка, посмотрим, что за информация содержится в отчете, на примере тех тест- систем, которые часто применяются в российских лабораториях.

ViroSea HIV-1. В составе этого отчета анализированная последовательность генома ВИЧ отсутствует, и извлечь ее оттуда нельзя. Вместо этого там есть много другой информации, размещенной на пяти страницах.

На первой странице находятся данные о пациенте (ФИО, пол, возраст) и анализе (номер, дата назначения, фамилия врача, учреждение и др.). Далее в виде таблицы размещена вся главная информация по интерпретации теста. Вариантов ответа в крайней правой колонке три: «устойчивость» (resistance), «возможна устойчивость» (possible resistance) и «устойчивости нет» (попе). Эти ответы относятся к индивидуальным препаратам, названия которых указаны в средней колонке. Ответ resistance значит, что обнаруженные в образце мутации связаны с устойчивостью к препарату. Ответ possible resistance выдается, если мутации, обнаруженные в изученном образце, могут вызывать сниженную чувствительность, но не у всех пациентов. Ответ попе

означает, что в данном вирусе не выявлены мутации, связанные с устойчивостью к данному препарату.

Здесь же в нижней части таблицы указаны мутации устойчивости, которые были обнаружены в геноме ВИЧ в ходе анализа. Собственно, нелюбопытный врач может этим результатом удовлетвориться, не интересуясь тем, что написано на следующих страницах.

Между тем на второй странице находится довольно интересный перечень мутаций, которые не имеют прямого отношения к устойчивости, но могут быть важны для оценки свойств вируса с применением дополнительных инструментов.

Третья и четвертая страницы сообщают о том, какие именно правила были использованы для интерпретации результата анализа. В правой колонке таблицы перечисляются все мутации, которые когда-либо были

замечены в связи с устойчивостью к соответствующим препаратам (названия их и классы указаны в средней и левой колонках, соответственно). Степень ассоциации каждой мутации с устойчивостью отражена различиями шрифта и цвета; так, если мутация заключена в фигурные скобки, {выделена красным цветом и жирным шрифтом}, то это означает очень сильную связь между наличием мутации и вероятностью ее связи с устойчивостью (практически наличие такой мутации всегда вызывает резистентность ВИЧ). Мутации в квадратных скобках, [выделенные синим цветом и жирным курсивом], имеют меньшую степень ассоциации (такая мутация не обязательно вызывает устойчивость). В (черные круглые скобки) заключены мутации, способные вызвать устойчивость к препарату только в сочетании с другими мутациями ге-

нома ВИЧ. Наконец, мутации в угловых скобках, [выделенные зеленым цветом], способны возвращать вирусу чувствительность (например, мутации гиперчувствительности). Если мутации помечены одной, двумя или тремя звездочками (*, ***, ***), это означает, что они пока еще недостаточно охарактеризованы, либо не хватает клинических данных, либо и то, и другое.

Пятая страница содержит список ссылок на публикации и рекомендации, принятые в расчет при интерпретации данных.

TruGene HIV-1. Этот отчет тоже размещен на 5-6 страницах и имеет похожую структуру, однако есть и отличия. Главная информация - результат интерпретации обнаруженных мутаций тоже находится на первой странице, однако здесь уже не три градации, а четыре: «устойчивость» (resistance), «возможна устойчивость» (possible resistance), «нет признаков устойчивости» (по

evidence of resistance) и «не хватает данных» (insufficient evidence). Эти результаты помечены разными цветами - красным, оранжевым, зеленым и черным, соответственно, и так же помечены препараты, по отношению к которым сделаны выводы, что дополнительно облегчает задачу врача, хотя и оставляет мало простора для творчества. Перечень мутаций, обнаружение которых привело к таким выводам, находится здесь же, над каждой из таблиц, относящихся к разным классам препаратов.

Гораздо интереснее устроена вторая страница отчета - здесь подробно разъясняются основания для сделанных на первой странице выводов. В левой части таблицы обнаруживается список препаратов, которые на первой странице так или иначе обратили на себя внимание. Под каждым

из них - перечень связанных с ним мутаций в геноме ВИЧ и описание характера этих мутаций. В правой части таблицы - уровень доказательности, или доказательная база (evidence basis), обозначенная римскими цифрами.

Над созданием доказательной базы работает международная группа ведущих экспертов (Consensus panel); в ходе этой работы участники группы неоднократно встречаются на совещаниях и выступают с публикациями в журналах, после чего и вырабатывают единую позицию.

Уровень I соответствует правилам, основанным на двух или более независимых исследованиях, где конечный результат оценивался по достижению вирусологического успеха, дополненных данными, полученными in vitro. Уровень II также базируется на результатах исследований in vitro и предварительных данных о вирусологическом ответе. Уровень III основывается только на данных in vitro в тот момент, когда сведений о вирусологическом ответе еще нет. Наконец, алгоритм присваивает результату интерпретации уровень IV, когда никаких сведений о влиянии выявленных мутаций на чувствительность к препарату ни in vitro, ни in vivo пока не существует, но есть мнение экспертов, опирающееся на предварительные данные клинических испытаний или аналогию с другим препаратом того же класса.

Как видит читатель, некоторую дополнительную информацию можно извлечь и из отчета, если читать не только его первую страницу. Тем не менее, очень многие специалисты, по нашим наблюдениям, регулярно прибегают к дополнительному анализу последовательностей в системах on-line. В принципе, немало можно сделать и просто имея перед собой список мутаций устойчивости, потому что многие сайты для интерпретации допускают такую форму введения данных, однако автор этой книжки по-прежнему настаивает на анализе последовательности, поскольку именно такой вариант дает возможность трактовать мутации в контексте генома.

Stanford database. На знаменитом сайте Стэнфордского университета (http://hivdb.stanford.edu) находится не только система для интерпретации данных анализа резистентности ВИЧ, но и многих других полезных инструментов; с некоторыми из них в этой книжке читатель еще познакомится.

Собственно инструмент для интерпретации генотипа ВИЧ называется

HlVdb, его иконка находится в правом верхнем углу первой страницы сайта. Перейдя на следующую страницу, пользователь выбирает способ ввода данных - последовательность генома ВИЧ (analysis sequences) из собственного компьютера или список мутаций (analysis mutation list) (вручную или копированием из отчета тест- системы).

При выборе analysis sequences

на следующей странице опять можно сделать выбор между введением в текстовом формате или в виде файла. В виде текста последовательность вводят в формате fasta; это означает, что перед нею обязательно должен стоять значок «>» и номер, а сама последовательность должна начинаться с новой строки. Файловый вариант означает выбор файла с расширением fasta или GRF XML для последовательностей, полученных с помощью тест-системы TruGene.

При выборе analysis mutation list ввод мутаций осуществляется из раскрывающегося списка для обратной

транскриптазы, протеазы и интегразы ВИЧ так, как они перечисляются в составе отчетов.

После ввода данных любым способом остается решить, нужно ли в состав ответа добавить баллы для мутаций (mutation scores) и комментарии к ним (mutations comments), после чего нажать иконку «analyse». На следующей странице появится отчет об анализе.

В верхней части страницы находится раздел, содержащий данные общего характера: номер образца, номера кодонов, ограничивающих изученные последовательности обратной транскриптазы, протеазы и интегразы, а также наличие вставок и делеций.

Здесь также есть результат анализа принадлежности вируса к тому или иному подтипу ВИЧ с указанием степени родства с ближайшим референс- вариантом. Заметим, что сайт HlVdb не предназначен для субтипирова- ния ВИЧ и нередко дает ложные результаты. В настоящее время авторы активно работают над улучшением этой функции сайта; более подробно вопрос будет обсуждаться далее.

В левой части зоны оценки качества даны комментарии по наличию проблем в составе RT и PR, таких как

наличие стоп-кодонов, сдвигов рамки, неоднозначных позиций или нетипичных нуклеотидов (то есть встречающихся в базах данных реже чем у 0,05% вирусов). Красными штрихами обозначены проблемные позиции генома в участках, связанных с лекарственной устойчивостью ВИЧ. Синим указаны позиции, отличающие исследованный вирус от консенсуса подтипа В, причем высокие находятся в участках, ассоциированных с устойчивостью, а низкие - в прочих участках. Наличие красных индикаторов

не позволяет учитывать результат интерпретации и требует дополнительного анализа исходных результатов на предмет поиска ошибок; синие индикаторы всего лишь свидетельствуют о том, что вирус обладает отличиями от «среднего» варианта.

В средней части страницы находится описание результата анализа резистентности к ИП. Мутации устойчивости подразделены на три категории - основные (major PI resistance mutations), минорные (minor PI resistance mutations) и прочие (other mutations). Как уже знает читатель, к основным относят мутации, которые непосредственно вызывают устойчивость ВИЧ; минорные мутации обычно не вызывают устойчивости, но могут вносить свой вклад в формирование этого феномена в качестве компенсаторных. И те, и другие получают баллы (см. далее) и описание в комментариях. Прочим мутациям баллов не присваивают, но иногда описывают в комментариях, например, когда они очень необычны.

Далее следуют препараты группы ИП с указанием оценочного уровня устойчивости, то есть собственно интерпретация. Для оценки чув- ствительности/устойчивости вируса установлено пять уровней: чувствительный (susceptible), возможна низкая устойчивость (potential low- level resistance), низкая устойчивость (low-level resistance), промежуточная устойчивость (intermediate resistance) и высокая устойчивость (high-level resistance). В этом пункте мы еще остановимся чуть ниже.

Аналогичным образом сформировано заключение по ингибиторам обратной транскриптазы, которые разделены на три категории - мутации к НИОТ (NRTI-resistance mutations), мутации к ННИОТ (NNRTI-resistance mutations) и прочие (other mutations). Первым двум присваиваются баллы, а третья категория остается без них.

Заключительная часть отчета содержит таблицу баллов всех мутаций (mutation scoring), найденных в анализированной последовательности ВИЧ. Всем мутациям присваиваются баллы по отношению ко всем препаратам класса; щелкнув по соответствующей цифре балла, можно выйти в окно, посвященное описанию последствий мутаций в данной позиции генома применительно ко всем потенциальным препаратам.

О том, как формируется таблица баллов, следует поговорить особо, потому что на этот счет у российских специалистов существуют некоторые заблуждения. Многие принимают баллы, находящиеся в этой таблице, за степень снижения чувствительности ВИЧ, между тем как содержание этого показателя совсем другое. Внимательный читатель отметил, что шкала в таблице прерывистая (5,10,15 и т.д.), что свидетельствует об ее искусственном происхождении, опирающемся на мнение экспертов. В свою очередь, это мнение основывается на нескольких источниках.

Первый из них - это публикации, посвященные анализу связи между мутациями и наличием терапии. Те мутации, которые обнаруживаются без всякой связи с лечением (то есть мутации полиморфизма), баллов обычно не получают, потому что не вносят вклада в устойчивость вируса и чаще всего просто отражают принадлежность к какому-либо подтипу ВИЧ.

Вторая группа данных касается связи мутаций со сниженной чувствительностью к препаратам in vitro. Если такие данные есть, мутация получает высокий балл, особенно если она обладает таким свойством в отсутствие других мутаций (степени снижения чувствительности эти баллы не пропорциональны). Чаще всего такая информация поступает из исследований, в которых параллельно анализируются генотип и фенотип клинических вариантов ВИЧ. Мутациям, которые, наоборот, повышают чувствительность, присваивают отрицательные баллы.

Третий источник сведений - публикации, в которых описывается связь

предсуществующих мутаций с вирусологическим эффектом схемы терапии. Чем чаще мутация связана со сниженным ответом, тем больше баллов она получает, при этом степень снижения ответа, то есть повышения нагрузки, здесь опять-таки не учитывается.

Таблица баллов часто пересматривается с учетом новых данных; последний вариант полного списка всех баллов для всех мутаций можно найти на сайте Стэнфорда в разделе Drug Resistance Summaries.

Интерпретация по Стэнфорду действительно строится на подсчете суммы баллов, но, как еще раз хочется подчеркнуть, результат этой интерпретации отражает главным образом не степень снижения чувствительности вируса, а частоту ассоциации выявленных мутаций с резистентностью.

Согласно такой системе подсчетов, чувствительным (susceptible) признают вирус, получивший от 0 до 9 баллов; чаще всего это вирус «дикого» типа.От 10 до 14 баллов получает вирус, в составе генома которого обнаружили мутации, возможно, свидетельствующие о терапии в прошлом, но не влияющие заметно на эффект терапии; у такого вируса устойчивость возможна, но маловероятна (potential low-level resistance).

Вирусы с «низкой устойчивостью» (low-level resistance)HMeiOT сниженную чувствительность in vitro, вызывая у некоторых пациентов субоптимальный вирусологический ответ; они находятся в промежутке от 15 до 29 баллов. Промежуточная устойчивость (intermediate resistance) (30-59 баллов) предполагает устойчивость ВИЧ, превышающую низкую, но не достигающую высокой. Наконец, высокая устойчивость (high-level resistance) - свойство вирусов, набравших от 60 до 100 баллов; они способны вызывать высокий уровень резистентности in vitro, и/или пациенты с такой мутацией, как правило, практически не отвечают на терапию.

Табличка, появляющаяся в конце отчета, включает в себя всю информацию о вирусе пациента дополнительно к информации, расположенной в верхней части, где указаны только категории интерпретации. Нередко это может помочь врачу более точно сориентироваться в отношении выбора препаратов в новой схеме; например, выбирая между двумя препаратами с «суммарной» промежуточной устойчивостью 32 и 55, разумно будет выбрать лекарство с более низкими баллами.

Для врачей, готовых серьезно изучить вопрос об источниках данных по каждой из мутаций, есть еще один инструмент - MARVEL (Mutation ARV Evidence Listing), позволяющий выбрать интересующую мутацию и все о ней прочитать. Формат изложения при этом включает все перечисленные источники, то есть корреляции мутации-лечение, мутации-фенотип и му- тации-вирусологический ответ. Другие варианты использования Стэнфордского сайта с целью оценки эффективности терапии будут рассмотрены ниже.

В заключение заметим, что цель HlVdb и аналогичных ей программ состоит в том, чтобы определить вероятность эффективности препарата в отношении изученного вируса по сравнению с «диким» вариантом, но не в том, чтобы подобрать схему терапии. Программы, способные выполнять эту работу, находятся в процессе разработки и оптимизации, и об одной из них - EuResist речь пойдет в следующих главах.

Возможности использования сайта врачами очень велики, и доктора всего мира активно им пользуются, однако сайт англоязычный, и это в большой степени ограничивает его использование в России, где врачи в большинстве своем языка не знают. Ситуацию мало может исправить перевод страницы интерпретации генотипа ВИЧ на русский язык, сделанный специалистами ЦНИИ эпидемиологии (http://hivresist. pcr.ru) - так называемое «зеркало Стэнфорда», потому что это - лишь крошечная часть потенциала, оставляющая все остальные инструменты недоступными. Можно лишь пожелать нашим врачам расширить свои языковые познания для того, чтобы встать вровень с международными специалистами в отношении владения Интернет-ресурсами.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >