Методы определения репликативной способности ВИЧ

Вопрос о разнице между фитнесом и репликативной способностью ВИЧ уже обсуждался в предыдущих главах. Коротко напомним, что понятие

фитнеса описывает способность вируса к размножению в условиях реального окружения и количественной оценке in vitro практически не поддается. Некоторые работы были посвящены разработке животных моделей для сравнительной оценки репликации ВИЧ (например, линия мышей SCID-hu Thy/Liv), однако очевидно, что адекватными эти модели считать нельзя, поскольку процесс размножения вируса в организме человека они напоминают очень отдаленно.

Репликативная способность (PC) - это лабораторный показатель, который специально придуман для того, чтобы вирусные штаммы все- таки можно было сравнивать между собой, пусть и в искусственных условиях, и хотя этот вид анализа пока еще не нашел применения в рутинной практике, читателю может быть интересно узнать о том, как он организован и как выглядят его результаты.

Все тесты для определения PC построены по единому принципу -

выводы о способности устойчивого штамма ВИЧ к размножению делают на основе его сравнения с «диким» штаммом. Оба вируса при этом обязательно должны находиться в одинаковых условиях, причем, как правило, главным условием является отсутствие лекарственного препарата. Это легко объяснить, ведь и PC - понятие относительное: пока препарат не действует на популяцию вируса, «выигрывает» более жизнеспособный «дикий» вирус, однако размножаться в присутствии лекарства он просто не может, и тогда лучшие показатели репликации (хотя и всегда хуже, чем у «дикого» вируса без лекарства) демонстрирует устойчивый вариант. Для того, чтобы привести условия эксперимента «к единому знаменателю», как правило, из опытов по анализу PC исключают

участие лекарства, если только этот эксперимент не ставит перед собой какую-либо особую задачу. Результат анализа репликации устойчивого вируса в сравнении с «диким» обычно выражают в процентах.

Первый и самый прямой подход основан на измерении уровня продукции вируса (например, путем количественной оценки антигена р24) в супернатантах культур клеток, которые параллельно заражают контрольным и исследуемым вирусами. На оси абсцисс соответствующего графика откладывают время, а на оси ординат - результат измерения р24. Метод анализа кинетики репликации обладает низкой чувствительностью и позволяет проводить лишь очень приблизительное сравнение вирусов.

Другой метод по дизайну практически не отличается от знакомых читателю фенотипических тестов (например, PhenoSense), когда репликацию ВИЧ оценивают по уровню свечения клеток, в которых размножается искусственный геном, включающий последовательности исследуемого вируса и гена люциферазы. Аналогичная схема использована в тесте Phenoscript (Viralliance, France). Исследование проводят в одном цикле заражения (single-cycle replication assay), и это можно отнести к его достоинствам, поскольку занимает немного времени (два дня). Для заражения используют несколько фиксированных концентраций вирусных частиц, чтобы построить график. Лекарство в этом варианте тестирования может и присутствовать, и тогда анализ PC будет происходить одновременно с измерением кратности устойчивости (FC). Разница в расчетах с определением FC заключается в том, что результат оценки PC рассчитывают как отношение интенсивности люциферазной люминесценции в образце от пациента к «дикому» образцу, выраженное в процентах. Чувствительность этих методов также ограничена и выявляет в основном заметные изменения PC,

например, у вариантов с устойчивостью к ИП.

«Золотым стандартом» для определения PC ВИЧ считается конкурентный метод (growth competition assays), и это обоснованно - ведь только при таких условиях постановки опыта оба испытуемых варианта вируса действительно размножаются в абсолютно одинаковых условиях. Для этого смесью обоих вирусов в определенных соотношениях заражают одну и ту же культуру клеток. Образующиеся в результате экспоненциального размножения вирусные частицы используют для заражения следующего пассажа, повторяя эту процедуру несколько раз, после чего анализируют состав получившейся популяции вирусов.Принцип такого анализа основан на наличии определенных генетических маркеров у каждого из вирусов, и это - самая сложная часть исследования, включающая секвенирование РНК или провирусной

ДНК, а иногда и дополнительные манипуляции. Показатель PC рассчитывают, исходя из скорости замещения менее жизнеспособного штамма вируса (обычно устойчивого) более жизнеспособным вариантом.

Главное достоинство конкурентного метода - его высокая чувствительность к различиям между штаммами; в зависимости от объема инфекционной дозы, выбора культуры клеток и соотношения вирусов в момент заражения селективные преимущества одного из вариантов могут быть продемонстрированы с высокой воспроизводимостью. Проблема его использования - длительное время выполнения (несколько недель); кроме того, страдает и способ раздельной оценки репликации по накоплению генетических маркеров в смеси, поскольку любая амплификация, проведенная в ходе анализа, может приводить к перераспределению соотношений в силу изменчивости генома

ВИЧ и возможных ошибок обратной транскрипции. Тем не менее, именно с помощью этого метода удается провести анализ тонких различий PC ВИЧ, например, когда они составляют всего 1,5-2 раза.

Фенотипические методы определения PC пока еще далеки от рутинного использования. Очевидно, что предсказание этого показателя на основании исследования генотипа могло бы стать хорошей альтернативой, и попытки создания таких алгоритмов тоже делаются; в их основе лежат сложные математические подходы, и в этой книге мы не станем на них останавливаться. О том, как можно применить информацию о репликативной способности ВИЧ на практике, пойдет речь в следующих главах.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >