Анализ тропизма ВИЧ

Вопросы механизмов действия антагонистов корецепторов подробно обсуждались в предыдущей главе, и теперь уже читатель знает, почему перед назначением маравирока обязательным требованием является определение тропизма ВИЧ у пациента. У наивных пациентов в 80-85% случаев (а по нашим данным, полученным для варианта подтипа А, доминирующего в России, эта цифра еще выше) выявляются только RS-вирусы; на более поздних стадиях у леченых пациентов такой вирус встречается лишь в 50- 56% случаев. Таким образом, принимая решение о назначении пациенту MVC, необходимо убедиться в том, что Х4-вирусов у него нет, иначе лечение не имеет смысла, ведь в этом случае вирус использует другие рецепторы - CXCR4, и тогда для него будет не важно, блокированы при этом CCR5- корецепторы или нет.

Для определения тропизма ВИЧ, так же как для анализа резистентности, используются две группы тестов - фенотипические и генотипические. Принципы, на которых они базируются, те же - первая группа непосредственно оценивает способность вируса использовать те или иные коре- цепторы, вторая группа анализирует геном и выводит свойства вируса из его особенностей.

Фенотипирование. Самый известный из фенотипических тестов для определения тропизма ВИЧ называется Trofile™ (компания Monogram (Biosciencelnc.), США). Принцип, заложенный в основу его работы, очень напоминает принцип, по которому устроены фенотипические тесты, например, Phenosence (см. выше).Есть, однако, и разница, связанная с тем, что механизм действия антагонистов корецепторов, действующих вне клетки, принципиально отличает их от ингибиторов вирусных ферментов, работающих внутриклеточно.

Ген env, полученный из РНК вируса пациента, клонируют в составе специального вектора и вводят в чувствительные «упаковочные» клетки. Одновременно с ними в клетки внедряют молекулу другого вектора, которая содержит все прочие гены ВИЧ, кроме env, место которого занимает ген люциферазы. В случае успешного объединения генов образуются вирусные псевдочастицы, способные только к одному циклу размножения, в ходе которого одновременно экспрессируются как вирусные гены, так и люцифераза.

Этот цикл они осуществляют в СЭ4+клетках специализированных культур, которые имеют на своей поверхности либо CXCR4, либо CCR5. В ходе культивации к этим клеткам добавляют или не добавляют соответствующие ингибиторы CXCR4 или CCR5, блокирующие корецепторы. Если псевдочастицы сумели проникнуть в клетку (то есть использовали соответствующий корецептор) и размножились, цитоплазма будет

светиться. Для решения вопроса о тропизме испытуемого вируса производят сравнение результатов между ячейками, в которых присутствовали или отсутствовали ингибиторы. Вирус, который обеспечивает свечение лишь в ячейке СС[Ч5-линии без добавления ингибитора CCR5, относят к R5- группе; вирус, манипуляции с которым приводят к свечению только ячейки CXCR46e3 добавления ингибитора CXCR4, признают Х4-тропным. Если положительный результат обнаруживается на обеих линиях, регистрируют вирус, обладающий двойной тропно- стью (dual/mixed, D/M).

Способ определения ингибирующей концентрации MVC и его аналогов тоже отличается от традиционного определения 1С50 (см. выше), основанного на сравнении с «диким» штаммом, который по достижении определенной концентрации лекарства вообще перестает размножаться. Антагонисты корецепторов не способны полностью ингибировать репликацию ВИЧ, в каких бы дозах они не применялись, то есть начиная

с некоторой концентрации уровень репликации выходит на плато, когда дальнейшее добавление препарата уже ничего не меняет. На этом и основан способ оценки действия MVC, при котором1С50 рассчитывают на основе построения сигмовидных кривых зависимости степени подавления репликации (в % по отношению к тому же образцу вируса без добавления ингибитора) от концентрации препарата.

Минимальная вирусная нагрузка для Trofile составляет 1000 копий РНК/мл, при этом он способен выявлять Х4-штаммы, если они содержатся в популяции в доле от 1 до 10%. Недавно появилась новая версия - так называемый Trofile Enhanced Sensitivity (TF-ES) с чувствительностью до 0,3% (клиническое значение выявления минорных штаммов будет подробнее освещено в следующей главе). Выполняет тест единственная организация, базирующаяся в Сан-

Франциско (Monogram); альтернативой Trofile является Phenoscript assay (VIRalliance, Париж, Франция) с аналогичной схемой постановки и некоторые другие тесты. Время, требуемое для выполнения фенотипирования - две недели; примерно 5% образцов не удается исследовать по причине неудачи амплификации гена env.

Г9нотипирование. Те же причины, которые побуждают создавать и развивать методы генотипирования с целью оценки резистентности, направляют ученых и в разработке генотипических подходов к анализу тропизма ВИЧ. Основной ген, который кодирует все белки Env, это, конечно, ген env, а главная его часть, определяющая тропизм вируса, - это петля V3. Сразу же заметим, что на тропизм влияет не только структура петли V3, но и, до некоторой степени, и другие участки, в частности, петли V1 и V2 и даже консервативные последовательности С1-С2.

Для определения структуры петли для начала необходимо ее секвени- ровать, что само по себе задача непростая, потому что ген env поддается амплификации хуже остальных генов ВИЧ. Попытки увеличить размер ам- пликона за счет добавления соседних участков лишь усложняют задачу, поэтому большинство современных тестов не включают дополнительных участков и ограничиваются лишь V3- петлей, что значительно снижает их чувствительность (так мы станем обозначать эффективность выявления Х4-вариантов ВИЧ).

Проблема интерпретации результатов секвенирования /3-петли в первую очередь связана с тем, что различия ее структуры у R5 и Х4 штаммов не носят отчетливого характера. Это означает, что нет единого критерия, по которому можно было бы отнести вирус к одному классу, поэтому приходится, как всегда в таких случаях, идти другим путем - собирать обширные базы данных вирусов с известными генотип-фенотипами и пытаться вывести некоторые алгоритмы, позволяющие сделать вывод о тропизме на основании анализа последовательности ДНК /3-петли ВИЧ. На данный момент таких алгоритмов разработано несколько, и совершенных среди них нет.

Самый простой подход основан на сравнении позиций 11 и 25 петли

V3 - именно по этим позициям статистические различия между R5 и Х4 штаммами особенно заметно выражены (на рисунке последовательности ДНК V3 изображены в виде логотипа, в котором размер букв соответствует частоте встречаемости их в каждой из позиций, weblogo.berkeley.edu). Программа «правило 11/25» (11/25 rule) включает в себя оценку 1) наличия положительно заряженных аминокислот в 11 и 25 позициях и 2) общую оценку заряда /3-петли. На практике, выявление R или К в 11 и/или 25 позициях либо ([K+R] - [D+E]>5) соответствует Х4-фенотипу.Чувствитель- ность метода при работе с вирусами в культуре клеток составляет около 60%, в реальной популяции вируса с использованием метода популяционного секвенирования способность «правила 11/25» предсказывать Х4- фенотип еще меньше - 33%, по сравнению с Trofile, при специфичности 93%; в сочетании с данными о числе

CD4+ клеток чувствительность несколько повышается. Несмотря на низкую чувствительность, этот подход неплохо себя зарекомендовал в прогнозировании клинической прогрессии ВИЧ-инфекции.

Другая группа методов основана на биоинформационных подходах с более сложной математикой, включая построение дерева решений (decision trees), нейрональные сети (neural networks), support vector machines (SVM) и position-specific scoring matrices (PSSM). Для более подробного ознакомления с этими методами автор отсылает читателя к специальной литературе. Чувствительность их в сравнении с фенотипическими методами все еще оставляет желать лучшего и колеблется, по разным оценкам, от 50% до 88%;специфичность составляет около 90%. Особые трудности возникают при анализе вирусов неВ-подтипов, как это часто бывает и что легко понять с учетом того, что

большинство алгоритмов интерпретации данных о генотипе ВИЧ были получены в развитых странах, где превалирует подтип В.

Наконец, еще один вариант определения тропизма ВИЧ построен на анализе так называемых гетеродуплексов (heteroduplex tracking assays). Для его выполнения ампли- фицированную последовательность /3-петли, полученную из вируса пациента, гибридизуют с референс- последовательностями R5 и Х4, после чего проводят электрофорез. Подвижность полученных гибридных молекул зависит от эффективности гибридизации, а она, в свою очередь, определяется степенью комплементарности гибридизуемых последовательностей. Если испытуемый образец - R5- тропный, он гибридизуется с R5, и результирующий гибрид будет быстрее двигаться в электрическом поле, чем в треке, соответствующем гибридизации с Х4, и наоборот. Примером такого теста может быть SensiTrop assay (Pathway Diagnostics, США), чувствительность и специфичность которого, по данным испытаний, составила 42% и 93%, соответственно. На смену этому тесту пришел CE-HDA assay (Quest Diagnostics), сочетающий анализ V3- петли с гетеродуплексным анализом. В России пока применяются только тесты, основанные на секвенирова- нии /3-петли, с последующей интерпретацией on-line.

Интерпретаиия результатов. В условиях клинической лаборатории интерпретация данных секвенирования /3-петли, так же как и для любых генотипических тестов, проводится с использованием специально разработанных программ; некоторые из них являются коммерческими, то есть ассоциированы с определенными видами тестов, однако основные программы для определения тропизма находятся в свободном доступе on-line (geno2pheno coreceptor: http://coreceptor.bioinf.mpi-sb.nnpg.de/ cgi-bin/coreceptor.pl; web-PSSM: http:// indra.mullins.microbiol.washington.edu/ webpssm/; Wetcat: http://genomiac2. ucsd.edu:8080/wetcat/tropism.html). Наиболее широко используемая программа содержится в составе известного сайта geno2peho (http:// coreceptor.geno2pheno.org), и о том, как пользоваться этим инструментом, речь пойдет в следующей главе, а здесь мы остановимся на его идеологической основе.

Принципиальная задача тестирования заключается в том, чтобы исключить присутствие Х4 и D/M штаммов ВИЧ у пациента, которого предполагают лечить с применением маравирока. В распоряжении исследователя находятся последовательности /3-петли белка др120, на основании оценки которых следует отнести вирус к тому или иному типу тропности. Для того, чтобы произвести эту оценку, последовательность сравнивают с базой данных последовательностей /3-петли вирусов с известным тропизмом (в базе содержится geno2peho их содержится около 1100). Дальнейшие объяснения будут относиться к рисунку.

Представим, что результатом анализа /3-петли (то есть сопоставления с базой данных) становится некоторый интегральный количественный показатель (назовем его Параметр). На совмещенной гистограмме показаны распределения Параметров двух групп вирусов - R5- и Х4-тропных (зеленая и оранжевая гистограммы,

соответственно); по оси X отложены значения Параметра, а по оси Y - число образцов с соответствующим значением Параметра в популяции. Поскольку задача состоит в том, чтобы выявить Х4-варианты, назовем такие образцы положительными, а образцы вирусов, не способных использовать СХСР4-корецептор (то есть Иб-вирусы) - отрицательными. Из рисунка хорошо видна тенденция - чем выше значение Параметра, тем больше вероятность того, что образец будет положительным (то есть окажется в зоне Х4). Видно, однако, и другое: гистограммы заметно перекрываются, то есть значительная часть положительных образцов имеет невысокие значения Параметра, а некоторые отрицательные образцы, наоборот, оказываются в правой части оси X. В этом пункте и возникает проблема выбора - как разграничить положительные и отрицательные образцы вируса на этой шкале, то есть, как найти cut-off?

Выбор очень непростой. Очевидно, что если cut-off установить на левой границе гистограммы положительных образцов (А) и к этой группе относить все, что находится правее, все положительные образцы будут успешно выявлены, однако при этом большинство отрицательных образцов тоже будут трактованы как положительные (то есть будет велика доля ложноположительных результатов, иначе говоря, будет наблюдаться низкая специфичность).

Можно поступить прямо наоборот и определить cut-off на правой границе гистограммы отрицательных образцов (Б); в этом случае ложноположительных результатов практически не будет, однако половина истинно положительных результатов будет «пропущена», и слишком низкой окажется чувствительность.

Читатель уже догадался, что верное решение заключается в том, чтобы провести cut-off в промежутке между А и Б (например, на уровне В), однако ему также понятно, что единственно «правильного» значения здесь быть не может, и выбор критерия зависит от решаемой задачи. Если задача - ни в коем случае не допустить ложнопозитивных результатов, при этом некоторого количества Х4-вирусов можно и не заметить, тогда выбор cut-off нужно сделать со сдвигом вправо. Если задача - выявить как можно больше Х4-вариантов, то есть исключить все ложные негативы, следует снизить значение этого критерия.

Результатом анализа генома ВИЧ на сайте geno2pheno становится показатель FPR (false positive rate), в русскоязычной литературе обозначаемый как «уровень допустимости ложноположительных результатов»; этим термином обозначают долю RS- вирусов, ошибочно интерпретированных как Х4-тропные. Например, если FPR у вируса, выделенного от пациента, равен 0,5%, это означает, что, скорее всего, это Х4-тропный вирус, потому что вероятность ошибки очень маленькая. Напротив, если FPR равняется 90%, предсказание Х4-тропизма на 90% ошибочно, и вирус, по всей видимости, принадлежит к группе R5-TponHbix. Окончательное решение о назначении маравирока принимается с учетом выбранного cut-off, или критического показателя FPR.Ha практике его устанавливают непосредственно в момент анализа последовательности на сайте, и технические аспекты этого процесса будут обсуждаться в следующей главе. Тем не менее, именно практикующему специалисту полезно знать, откуда берется этот показатель.

Итак, FPR - это основной показатель, который рассчитывается на основании анализа /3-петли и отражает долю ошибочных результатов определения Х4-фенотипа; критическая величина FPR напрямую связана со специфичностью теста. По определению, специфичность - это доля отрицательных результатов среди отрицательных образцов, выраженная, как правило, в процентах. FPR, напротив, - это доля положительных результатов среди отрицательных образцов, поэтому рассчитывается она как «100% минус специфичность». Например, если исследователь устанавливает критический FPR на уровне 10%, это означает его согласие с тем, что 10% образцов вирусов, в действительности неспособных использовать Х4-корецептор (то есть Р5-тропных), будут трактованы как Х4-тропные. Если же он хочет повысить надежность результата, то ему придется пойти на компромисс и снизить FPR, например, до 5%, при этом он заранее соглашается с тем, что часть истинно Х4-вирусов будет им не выявлена.

В клинических условиях задачи выбора критического FPR действительно возникают, однако большинство специалистов предпочитает его не варьировать, а ориентироваться на некоторые рекомендуемые постоянные значения (например, 10%); подробнее см. следующую главу.

Генотипические тесты не способны отличать Х4-вирусы от вирусов с двойной тропностью (D/М), однако до недавнего времени считалось, что на эффективности прогнозирования действия MVC это никак не сказывается. В последнее время получены данные о том, что у некоторых пациентов с D/М вирусом лечение MVC оказывается вполне успешным. Никаких выводов по этому поводу пока сделать нельзя, но следить за обновлением этой информации нужно обязательно.

В заключение заметим, что среди тестов на тропизм ВИЧ нет ни одного, который мог бы дать результаты, позволяющие однозначно прогнозировать успех лечения маравироком и его аналогами. И фено-, и геноти- пирование могут ошибиться в оценке или не выявить вирусы, присутствующие в популяции в незначительных количествах; клиническое значение минорных вирусов мы еще обсудим в следующей главе. Некоторые специалисты предлагают придерживаться такой тактики: вначале применить генотипирование; если вирус будет определен как Х4-тропный, результат считать окончательным и не применять для лечения антагонисты CCR5, если результаты генотипирования неопределенные или отрицательные - продолжить исследование методом фенотипирования.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >