Фенотипическое тестирование устойчивости

По объективным причинам, которые уже обсуждались выше, надежность генотипического анализа далека еще от 100%, причем известно, что по мере приобретения опыта лечения, то есть числа неуспешных схем, назначенных пациенту, интерпретация данных о генотипе ВИЧ становится все сложнее и сложнее, а выбор лекарств все более ограниченным. Практически, интерпретация генотипа наиболее эффективна у пациентов, которые испытали неуспех лечения впервые. Число мутаций у них обычно невелико, а их сочетания стандартны; отсутствие мутаций у таких пациентов часто является результатом недостаточной приверженности. Этот же метод хорошо подходит для оценки первичной устойчивости в порядке эпидемиологического слежения (см. далее), но для предсказания эффективности схем лечения у пациентов с множественной резистентностью ВИЧ практически непригоден.

Фундаментальная причина этого заключается в так называемом взаимодействии мутаций, одновременно присутствующих в составе генома. В действительности, конечно, речь идет о взаимном влиянии аминокислотных замен, каждая из которых вносит свой вклад в изменение свойств белка - фермента ВИЧ; предсказывать результат таких влияний, как мы уже говорили, пока невозможно.

Итак, чем больше мутаций накапливается в геноме ВИЧ пациента, тем труднее бывает интерпретировать их сочетание и подобрать действенную схему терапии. В таких случаях незаменимым способом выхода из положения становится фенотипирова- ние ВИЧ, которое позволяет получить прямой ответ на вопрос об истинной чувствительности вируса к антиретровирусным препаратам.

Методы фенотипирования не определяют индивидуальных мутаций, но зато позволяют непосредственно оценить их совокупный вклад в резистентность вируса. В ходе анализа этим методом конкретный вирус встречается с конкретным лекарством, и иногда достаточно эффективными, по данным фенотипирования, оказываются лекарства, к которым ранее были выявлены мутации устойчивости (более подробно в разделе о дискордантных результатах). Важным отличием фенотипирования от генотипирования является также возможность количественной оценки (кратности)сни- жения чувствительности вируса; этот показатель нередко помогает сделать единственный правильный выбор схемы лечения в условиях, когда вариантов остается немного.

Кратность устойчивости. Фенотипические тесты определяют способность вируса, выделенного от пациента, размножаться в культуре клеток in vitro в среде, содержащей лекарственные препараты. Для сравнения используют вирус, полностью чувствительный к действию препарата («дикий» вариант; в его роли выступает, как правило, стандартный лабораторный изолят ВИЧ). Очевидно, что чем выше концентрация лекарства, подавляющая репликацию вируса, тем более он устойчив к действию этого лекарства.

В качестве показателя, поддающегося измерению, обычно используют концентрацию препарата, ингибирующую размножение вируса на 50% (Ю50) или 90% (1С90). Стоит заметить, что эти показатели могут очень сильно, иногда на несколько порядков, различаться между препаратами. Мерой устойчивости вируса к данному препарату служит отношение 50 или 1С90 мутантного вируса к аналогичному показателю «дикого» варианта (этот параметр называют кратностью резистентности, fold change, FC).

Показатель кратности устойчивости, по определению, отражает степень снижения чувствительности вируса, то есть указывает, во сколько раз нужно повысить концентрацию препарата, чтобы подавить размножение устойчивого ВИЧ в культуре клеток. Показатель кратности у устойчивого варианта вируса всегда больше 1, а у гиперчувствительного, как легко догадаться, - меньше.

Оценивая этот показатель, следует всегда помнить о том, что его получают в искусственных условиях, и непосредственно для расчета дозы лекарства он не применяется. Иногда эффективность препарата можно восстановить путем повышения его дозировки, однако в абсолютном большинстве случаев в реальных клинических обстоятельствах это будет связано со слишком большим числом побочных эффектов, поэтому данные фенотипирования нужны только для получения информации о действительном спектре препаратов, чувствительность к которым сохранена или снижена незначительно.

Само по себе определение показателя кратности ничего не говорит клиницисту об устойчивости вируса: например, четырехкратное повышение FC для одного препарата означает почти полную чувствительность ВИЧ в организме пациента (то есть вирус по-прежнему не размножается при стандартной концентрации лекарства), а для другого - почти полную резистентность (то есть вирус способен к эффективной репликации при

назначении обычной дозировки). Так, НИОТ становятся резистентными при значениях FC гораздо ниже тех, которые приводят к устойчивости ингибиторы протеазы.

Вопрос, который логично возникает в этой ситуации, - при какой 1С50вирус все еще может считаться чувствительным к препарату? Для того, чтобы на него ответить, необходимо провести границу между резистентными и «дикими» штаммами, то есть определить пороговую величину 50для каждого препарата в отдельности.

Такой количественный критерий, разграничивающий чувствительные и устойчивые варианты ВИЧ, получил всем понятное наименование cut-off. После определения cut-off интерпретация данных фенотипирования становится очень простой задачей: если полученная при анализе величина меньше пороговой, штамм считают чувствительным, если больше - устойчивым, вот почему установление пороговых величин очень важно для правильной интерпретации результатов фенотипирования (см. далее). Проблема определения cut-off для всех антиретровирусных препаратов - первоочередная задача создателей фенотипических тестов, решается она давно и непрерывно, однако до сих пор решена не полностью, и это составляет одну из проблем использования фенотипирования в практике.

Понятие о технических, биологических и клинических cut-off. К вопросу определения cut-off можно подходить по-разному, и концепция оценки этого показателя претерпела определенную эволюцию.

Самый простой, технический вари- ант-использоватьодин-единственный референсный «дикий»штамм ВИЧ, многократно измеряя in vitro его чувствительность к изменяющимся титрам препарата и выстраивая кривую зависимости уровня репликации от концентрации изучаемого лекарства.

Этот тест, по сути дела, просто оценивает воспроизводимость результатов, при этом cut-off 1С50 устанавливается на уровне 95%-ного доверительного интервала, рассчитанного на основании полученных измерений. Все вирусы, у который 1С50 превышает технический cut-off, считаются устойчивыми, все остальные - чувствительными.

Ранние варианты фенотипических тестов - Phenosense и Antivirogram устанавливали пограничный уровень FC по сравнению с референсным штаммом (то есть FC, выше которого устойчивость вируса считалась значимой) равным 2,5 или 4, соответственно. Понадобилось не так много времени, чтобы понять, что такой подход далек от совершенства, и прежде всего потому, что не учитывает всего многообразия биологических свойств вариабельного вируса, тем более, что технические измерения оказались очень далеки от реальных клинических данных - когда их накопилось достаточно.

На смену такому подходу пришли так называемые биологические cutoff (biological cut-offs, ВСО), способные оценить естественную вариабельность «диких» вирусов. Сравнения с референс-штаммом применяются и здесь, однако для проведения испытаний in vitro используют не менее 1000 штаммов ВИЧ, выделенных от наивных пациентов, а сам FC cut-off рассчитывают, откладывая два (иногда три) стандартных отклонения (SD) вверх от среднего значения (или медианы) (FCmean) всех этих измерений. Таким образом, вирус, имеющий FC выше cut-off, расценивается как устойчивый по отношению к нормальному распределению чувствительности.

Такого рода исследования гораздо лучше учитывают разнообразие ВИЧ, однако методология ВСО все еще страдает от того, что не позволяет прямо связать между собой чувствительность вируса в условиях in vitro

с реальным клиническим эффектом. Определение ВСО проводится в лабораториях и сейчас, особенно на этапах разработки фенотипических тестов, при этом было введено усовершенствование: для участия в испытаниях отбираются только штаммы, в которых генотипирование подтвердило отсутствие мутаций устойчивости (ВСО второго поколения); так исключается возможность наличия мутаций у наивных пациентов вследствие заражения устойчивым штаммом.

Тем не менее, дальнейшая эволюция фенотипирования привела к осознанию того факта, что лучшие данные о чувствительности ВИЧ - те, что получены в условиях применения лекарств для лечения пациентов, то есть in vivo. Именно на эти результаты (настолько, насколько они доступны) опирается большинство баз данных, используемых для интерпретации результатов фенотипирования в современных тест-системах.

При определении клинических cut-off (ССО) используют данные, получаемые в клинических испытаниях лекарств от реальных пациентов. Пороговым считается значение FC, выше которого у пациентов наблюдается существенное снижение вирусологического ответа. Вопрос о том, что считать «существенным снижением», остается открытым.

Как уже упоминалось выше, устойчивость ВИЧ к лекарственным препаратам не относится к числу феноменов «все или ничего»; вариабельность вирусологического ответа и резистентности - понятия непрерывные, или, как говорят ученые, представляют собой continuum. Практикующему же врачу необходимо получить ответ на вопрос, является ли лекарство все еще активным, частично активным или практически не имеет активности

у конкретного пациента, иначе говоря, в какой части непрерывной шкалы резистентности находится этот пациент.

Для практических целей интерпретации тестов, созданных компаниями Monogram Biosciences и Virco, были разработаны и применяются так называемые нижние (lower) и верхние (upper) cut-off. Эти дополнительные пороговые величины FC учитывали степень снижения вирусологического ответа у пациентов в ходе клинических испытаний (%), которая, в свою очередь, была рассчитана индивидуально для каждого пациента как сложная математическая функция, зависящая от исходных вирусной нагрузки и FC, а также числа активных препаратов в схеме.

Такой дифференцированный подход определяет нижний cut-off, или СС01, как пороговую величинуВС, ассоциированную с умеренной (20%) потерей вирусологического ответа (сравнение производится с максимальным ответом у пациентов, несущих «дикий» вирус). Верхний cut-off, или СС02, связан со значительным (80%) снижением вирусологического ответа. Зона, расположенная между двумя пороговыми величинами - СС01 и СС02 соответствует промежуточной вероятности вирусологического успеха.

Иными словами, нижний cut-off отделяет вирусы, полностью чувствительные к лекарству, от вирусов, частично утративших чувствительность, а верхний cut-off дифференцирует вирусы со сниженной чувствительностью и резистентные вирусы.

Результат анализа FC, полученный в лаборатории, помещается на эту гибкую шкалу, после чего специалист с легкостью определяет положение вируса по отношению к данному препарату и делает вывод о его чув- ствительности/устойчивости. Такой способ интерпретации прост, удобен и дает максимально надежные предсказания эффективности лекарств. Проблема заключается лишь в том, что для составления подобной шкалы необходимо получить данные исследований в необходимом для статистики количестве, а это очень непросто, поэтому ССО существуют пока не для всех препаратов. Тем не менее, все современные фенотипические тесты основаны именно на таком подходе к анализу, и ВСО включаются в алгоритм исследования только в случае отсутствия ССО-данных.

Фенотипические тесты. Итак, у читателя уже сложилось представление о том, что все прямые методы оценки резистентности ВИЧ базируются на измерении репликации вируса в присутствии лекарственных препаратов.

Классический вариант фенотипи- рования основан на применении культур клеток, чувствительных к ВИЧ, причем в этом качестве, как правило, выступают мононуклеарные клетки периферической крови (peripheral blood mononuclear cells, PMBCs). Способ оценки репликации, который при-

менялся в лабораториях на ранних этапах изучения ВИЧ (главным образом при работе с лабораторными изо- лятами ВИЧ), использовал прямой подсчет бляшек, образующихся на культуре клеток после инкубации с вирусом. Метод был очень сложен: вначале вирус размножали на PMBCs, затем помещали его на монослой клеток HeLa, имеющих С04-рецептор, и инкубировали в присутствии лекарства. По окончании инкубации образовывались бляшки - «островки» мертвых клеток, которые окрашивали и подсчитывали визуально под микроскопом. Поскольку клетки HeLa не имеют ССИб-рецептора, таким способом в те времена можно было изучать только репликацию Х4-тропных вирусов. Позднее были получены клеточные линии, имеющие CCRS-рецептор, поэтому теперь ситуация несколько исправилась.

Улучшенная версия классического метода фенотипирования появилась в начале 90-х годов прошлого века и позволила изучать в условиях in vitro практически любые вирусы. Метод, впрочем, оказался ненамного проще в исполнении, поскольку требует предварительного периода совместной культивации мононуклеаров, выделенных от пациента, с клетками, выделенными от ВИЧ-негативного донора и стимулированными митогеном. Оценка репликации ВИЧ производится путем измерения продукции р24- антигена методом ИФА.

Очевидно, что для лабораторного анализа в клинике не подходит ни тот, ни другой вариант фенотипирования по причине сложности, дороговизны и продолжительности (время анализа может составить от двух-трех недель до двух-трех месяцев). Масштабирование проблемы резистентности ВИЧ поставило вопрос о разработке фенотипических тестов, пригодных для применения в рутинной клинической практике. Такие тесты были созданы, и в настоящее время доступны три коммерческих варианта - Antivirogram® (Tibotec-Virco), PhenoSense™ (Monogram Biosciences) и Phenoscript™ (Viralliance). Все они основаны на применении рекомбинантных технологий и включают, по сути, одни и те же процедуры.

На первом этапе амплифициро- ванная ДНК-копия РНК, выделенной от пациента, методами генной инженерии комбинируется с молекулой ДНК-вектора, которая включает в себя геном лабораторного штамма ВИЧ, лишенный области, кодирующей RT и PR (то есть имеющий делецию). В случае успеха полученный «гибридный» вирус способен экспрессировать молекулы RT и PR, аналогичные ферментам природного вируса пациента. На следующем этапе полученную конструкцию используют для заражения (трансфекции) чувствительных клеток, способных продуцировать вирус. Добавление лекарственных препаратов позволяет оценить степень чувствительности полученных вирусных частиц в сравнении с «диким» штаммом; мерой чувствительности является все та же 50, а результатом сравнения - FC.

Генные инженеры часто используют в своих конструкциях гены, продукты которых легко выявить, например, по окрашиванию какого-либо субстрата или свечению; такие гены называют репортерами (reporter). Примерами могут служить гены GFP (green fluorescent protein) - природный продукт медузы, мерцающий при

освещении определенной длиной волны, или ген люциферазы, кодирующий люциферин - фермент светлячков, благодаря которому они способны излучать зеленый свет в темноте. Эти подходы активно применяются и в составе фенотипических тестов. В качестве примера будет подробно описана одна из тест-систем - PhenoSense™.

Отличительной особенностью этой тест-системы является этап формирования специального вектора для тестирования резистентности (RTV, resistance test vector). У этого вектора, помимо участка для встраивания RT и PR пациента, отсутствует часть гена оболочки (env), а на его место встроен индикаторный ген люциферазы. При введении в чувствительные клетки такой вектор самостоятельно продуцировать инфекционные частицы не может, так как не в состоянии обеспечить синтез оболочечных белков, поэтому на помощь ему вводят еще один вектор, несущий ген белка оболочки вируса лейкемии мышей (MLV).

Попав в клетку, оба вектора начинают производить белки, которые они кодируют, при этом уровень продукции RT и PR пропорционален уровню синтеза люциферазы, потому что в составе рекомбинантной молекулы они находятся под контролем одного и того же промотора. Объединившись в цитоплазме с оболочечными белками MLV, белки ВИЧ формируют так называемые псевдочастицы. Такие частицы обладают способностью инфицировать клетки благодаря наличию «заимствованной» оболочки, но при этом обеспечивают только один цикл репликации (образующиеся в этом цикле новые частицы будут неполноценными по причине отсутствия собственного белка Env). Если на этом этапе добавить ингибиторы PR, то чувствительный к этим ингибиторам вирус инфекционных частиц не образует, а устойчивый даст потомство. Параллельно ведут определение чувствительности к ингибиторам RT; для этого псевдочастицами заражают следующий пассаж клеток, к которым добавляют люциферин - субстрат люциферазы. На этом этапе в культуру добавляют ингибиторы RT; если вирус к ним чувствителен, то он не сможет размножаться, а если устойчив, то сможет, и тогда одновременно с вирусными белками будет экспрессироваться и люцифераза, результатом чего и станет свечение цитоплазмы клеток. Понятно, что чем более устойчив вирус к действию того или иного препарата, тем сильнее будут светиться клетки; это свечение регистрируется и измеряется с помощью хемилюми- нометра. После этого остается только сравнить свечение опытного образца в присутствии лекарства и в его отсутствие и рассчитать кратность устойчивости.

Дополнительно к информации об устойчивости тест PhenoSense выдает результат анализа репликативной способности (PC) ВИЧ, выражая ее в процентах по отношению к вирусу «дикого» типа.

Тест Antivirogram™ в качестве чувствительной культуры использует линию клеток МТ4, имеющих CD4+ рецептор, вводя в них генно-инженерную конструкцию методом электропорации. Для оценки экспрессии ферментов пациента тест использует GFP.

Phenoscript™ позволяет проводить анализ трех областей генома - gag- PR, RT и env, а значит, дает возможность дополнительно определять устойчивость к ингибиторам слия-

ния. Продукты ПЦР вводятся в чувствительные клетки методом трансфекции вместе с тремя векторными плазмидами - отдельно для каждого класса препаратов. В качестве индикатора клетки содержат субстрат Р-галактозидазы; совместная экспрессия этого гена-репортера с вирусными ферментами под контролем LTR приводит к образованию окрашенного

продукта, количество которого измеряют с применением колориметрических методов.

Все три вида тестов дают хорошую воспроизводимость и достаточно похожие результаты; наиболее близкое соответствие наблюдается в отношении ИП и ННИОТ, для НИОТ разброс несколько больше.

Выполнение рекомбинантных тестов занимает, конечно, гораздо меньше времени, чем классический вариант («всего» 3-5 недель). Кроме того, некоторые процедуры рекомбинантного теста могут быть автоматизированы, а воспроизводимость результатов достаточно высока. К сожалению, чувствительность фенотипических тестов не отличается в лучшую сторону от генотипических - выявление резистентных штаммов возможно лишь тогда, когда они составляют от 10-20% популяции вируса, а вирусная нагрузка не менее 500 копий РНК/мл.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >