Методы секвенирования нового поколения

Все описанные выше методы секвенирования на первом этапе анализа применяют прием амплификации, при этом в реакции участвуют все молекулы РНК, которые удалось выделить из плазмы крови. Понятно, что, имея дело с квазивидовым вирусом, всякий раз амплифицировать приходится не один вид генома, а весь «рой» вирусов, среди которых могут быть и устойчивые к лекарствам. Такой вид секвенирования называют популяционным, и определенные недостатки в отношении анализа лекарственной устойчивости ВИЧ у него имеются.

Читатель уже слышал о том, что все стандартные тесты способны обнаружить устойчивые варианты ВИЧ лишь тогда, когда их доля в популяции вируса составляет не менее 20%, при этом подразумевается, что устойчивый и «дикий» варианты находятся в смеси. На практике это означает, что пик на электрофореграмме, составляющий менее 1/5 высоты основного пика (то есть «дикого» нуклеотида), просто не регистрируется и, таким образом, в отчете об анализе генотипа описываются только последовательности вирусов, присутствующих в большинстве (доминантные), а минорные варианты остаются незамеченными. Между тем, информация о них может быть очень важна для прогнозирования эффективности схем терапии (см. главу VII).

Еще сложнее бывает интерпретировать результат популяционного секвенирования, когда речь идет о множественной резистентности. Дело в том, что отчет об анализе генотипа ВИЧ, проведенном стандартным методом, выдает результирующие данные по каждой из позиций генома, однако не может дать ответа на вопрос, находятся ли основные мутации в составе одного и того же генома или принадлежат разным субпопуляциям вируса. Ответ этот может быть очень важен: легко понять, что если каждая из таких субпопуляций имеет, условно говоря, мутации только к одному препарату, то все субпопуляции будут чувствительны к схеме из трех лекарств, и терапия в целом сохраняет свою эффективность. Если же все выявленные мутации принадлежат одному геному, тогда интерпретировать полученные данные нужно совсем иначе, при этом необходимо будет дополнительно учесть возможность взаимодействия отдельных мутаций в составе одного варианта вируса.

В условиях клиники для анализа лекарственной устойчивости ВИЧ применяется популяционное секвени- рование, потому что этот метод проще и дешевле, однако для более глубокого анализа ученые уже разрабатывают другие подходы, среди которые находятся клональное секвенирование с применением конечных разведений, методы анализа отдельных точечных мутаций, а также группа методов, объединяемых термином «секвенирование нового поколения» (new generation sequencing, NGS) и основанных на одновременном анализе множества индивидуальных молекул ДНК. Процедура такого анализа обычно включает в себя несколько основных этапов:

  • • вначале анализируемую ДНК фрагментируют до небольших участков случайного размера, при этом, как правило, применяют технику shot-gun (дробовик)] в простейшем варианте для этого используют ультразвук или физическое разрушение молекул ДНК путем многократного пропускания через тонкую иглу шприца либо распыление (nebulization) с использованием специальных приспособлений;
  • • затем каждый фрагмент индивидуально амплифицируют (технологии амплификации различаются);
  • • полученные ампликоны индивидуально секвенируют;

• данные об индивидуальных последовательностях объединяют с применением специального программного обеспечения.

Точек приложения этих методов множество, и любопытный читатель найдет для себя много информации на эту тему в других источниках. Поскольку некоторые из этих методов имеют отношение к практике анализа лекарственной устойчивости ВИЧ, приведем здесь очень краткое описание нескольких примеров.

Самый известный из них - 454 Roche, основанный на ультраглубо- ком пиросеквенировании (ultra-deep pyrosequencing); появился он раньше других и уже имеет коммерческое

воплощение в виде опытной тест- системы для определения минорных вариантов ВИЧ.

Анализ включает в себя следующие стадии:

  • 1. Приготовление библиотеки фрагментов (shot-gun);
  • • двуцепочечную ДНК разрушают до фрагментов размером 300-500 н.п.
  • • присоединение меченых биотином праймеров и адаптеров; к обоим концам фрагментов «пришивают» короткие олигонуклеотиды, необходимые для обеспечения комплементарных взаимодействий на последующих этапах;
  • • двуцепочечную ДНК «расщепляют» на одноцепочечные молекулы.
  • 2. Эмульсионная ПЦР: фрагменты ДНК вместе с реагентами ПЦР и специальными шариками, покрытыми стрептавидином для захвата ДНК (beads), смешивают в водном растворе и вносят в пробирки с синтетическим маслом. После интенсивного перемешивания формируется эмульсия «вода в масле», состоящая из крошечных капелек. Концентрация шариков и ДНК подбирается таким образом, чтобы в каждую из этих капелек попала и адсорбировалась на шарике только одна молекула ДНК- фрагмента. В ходе реакции ПЦР каждая капелька выступает в роли «реактора», продуцирующего только один вид ампликонов в количестве десятков миллионов копий.
  • 3. Собственно секвенирование проводят в планшете, содержащем до полутора миллионов микрообъемных ячеек. В каждую ячейку помещается только один шарик; кроме него, там же находятся ДНК-полимераза и еще два фермента - сульфурилаза и лю- цифераза, а также субстрат, которые генерируют люминесцентный сигнал

на выходе реакции. Сама реакция секвенирования основана на последовательном включении нуклеотидов в растущую цепочку ДНК, при этом растворы нуклеотидов пропускают через ячейки планшета по очереди, каждый раз отмывая несвязанные молекулы; порядок пропускания, как правило, Т—>С—sTWG. Такой вид анализа называют «секвенированием путем синтеза» (sequencing by synthesis). Если при очередном пропускании в ячейке происходит присоединение нуклеотида, вырабатывается световой сигнал, если не происходит - сигнал отсутствует. Каждый «нуклеотидный раунд» сопровождается регистрацией сигнала, причем оптическая часть системы устроена таким образом, что сигнал от каждой ячейки регистрируется и записывается отдельно. Интенсивность сигнала пропорциональна числу включенных нуклеотидов в одном раунде (например, если последовательность содержит три G подряд, то при пропускании G будет получен сигнал, втрое превышающий сигнал от включения одного G).

4. Результат анализа последовательности в индивидуальной ячейке называется флоуграммой (flowgram) и выглядит как последовательность столбиков, цвет которых соответствует одному из нуклеотидов Т, С, А или G; например, на рисунке изображена флуограмма последовательности, которую следует читать как TCAGATCCGTGGGTG.

Принцип «секвенирования путем синтеза» использует и другая платфор- ма-lllumina, также популярная среди тех, кто занят анализом длинных последовательностей ДНК. Первый этап этого метода, аналогично 454, заключается в формировании библиотеки фраментов ДНК с «привязанными» на обоих концах адапторами. На этапе амплификации вместо шариков эта технология применяет поверхность ячеек, на которые нанесены

в смеси те же адаптеры; молекулы ДНК в ходе ПЦР образуют «мостики», поэтому такой способ носит название «мостиковой амплификации» (bridge amplification). Секвенирование образующихся кластеров ДНК проходит в тех же ячейках с участием обратимо меченых нуклеотидов (reversible dye terminator), которые добавляют последовательно в циклическом режиме (как в 454). Каждое событие включения меченого нуклеотида регистрирует оптическое устройство, после чего

нуклеотид деблокируют, и синтез продолжается.

Начальные этапы анализа с использованием платформы SOUD (sequencing by oligonucleotide ligation and detection) (LifeTechnologies) при- ниципиально не отличаются от 454 и lllumina. В качестве носителя для амплификации фрагментов библиотеки путем эмульсионной ПЦР применяются шарики; в конце этапа продукт ПЦР модифицируют таким образом, чтобы, наслоив эмульсию на стеклян-

ную пластинку, его можно было ковалентно к ней «пришить».

Технические отличия метода касаются главным образом стадии секвенирования, которое в этом случае носит наименование «секвенирования путем лигирования». В качестве «строительного материала» для построения цепи ДНК используют набор 8-членных олигонуклеотидов (октамеров), каждый из которых включает по одному из возможных сочетаний из двух нуклеотидов (например, АА, АС, AG, АТ и т.д.) и помечен на 5’-конце особой флуоресцентной меткой. В каждом цикле лигирования происходит распознавание двух рядом стоящих нуклеотидов и лигирование («сшивание») З’-конца октамера с растущей цепью ДНК, сопровождающееся регистрацией сигнала о включении метки. На следующем этапе концевые нуклеотиды, содержащие метку, вырезают, а несвязанные нуклеотиды отмывают. Преимущество такого подхода заключается, в частности, в значительном повышении точности двойного прочтения (например, если другие методы прочитывают последовательность как GACT, SOLiD прочитает ее как GA, АС, СТ и т.д.), то есть в каждой позиции имеется «подстраховка». Варианты метода и более детальное описание читатель отыщет в Интернете.

Последним этапом секвенирования любым из описанных методов является совмещение данных, полученных при анализе индивидуальных фрагментов. Для этого в каждом случае применяется специально разработанное для каждой платформы программное обеспечение, которое объединяет данные

от каждой молекулы ДНК в единую последовательность.

Технические характеристики этих платформ различаются, так же как и длина прочтений (reads); наибольшая длина (400-500 нуклеотидов) - у Roche; lllumina и SOLiD прочитывают от 35 до 50 нуклеотидов, поэтому при решении конкретных задач приходится учитывать эти, а также многие другие параметры. Кроме этих трех методов, имеется в распоряжении исследователей и разрабатывается множество других, основанных на оригинальных подходах, например, lonTorrent (Life Technologies), Helicos (BioSciences Corporation), MinlON (Oxford Nanopore Technologies) и т.д.; в этой книжке места им не нашлось, однако любознательный читатель обязательно разберется в этих вопросах самостоятельно.

Что касается определения резистентности ВИЧ, то, как уже говорилось выше, до стадии практического применения в клинике пока дошла только платформа 454, разработав экспериментальную тест-систему DeepChek. Составной частью отчета, получаемого в такой тест-системе, является информация о частоте встречаемости минорных мутаций, а также данные о содержании мутантного штамма в пересчете на вирусную нагрузку; также для сравнения в таблице приводится результат выявления каждой мутации стандартным методом. Кроме этого, отчет содержит привычную для клинициста таблицу с указанием названий лекарств и возможной устойчивости к ним с учетом выбранного порога чувствительности выявления миноров. Клиническое значение этих данных пока до конца не выяснено, и о степени значимости результатов, получаемых методами NGS, речь пойдет в следующей главе.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >