Генотипирование ВИЧ

Термин «генотипирование» утвердился в последние годы в практике специалистов, занятых в диагностике и лечении ВИЧ-инфекции, для обозначения анализа мутаций резистентности вируса. В этом значении он и будет употребляться далее, хотя читателю следует помнить, что действительное содержание этого термина существенно шире и включает все виды исследования генома ВИЧ, производимые любыми методами в любых целях (например, молекулярный мониторинг эпидемии ВИЧ-инфекции основан на генотипировании нескольких участков или полного генома вируса).

Общая процедура генотипирования. Независимо от вида теста (см. ниже) процедура генотипирования всегда начинается одинаково - на первом этапе производится выделение РНК из плазмы крови пациента. Как правило, для этого используют ту же порцию плазмы, в которой был повторно обнаружен повышенный уровень вирусной нагрузки в ходе количественного анализа РНК ВИЧ. Минимальное содержание РНК в пробе, предназначенной для генотипического анализа, составляет 1000 копий

РНК/мл; в отдельных случаях удается получить результат и при более низких значениях нагрузки (от 100 копий РНК/мл), однако в практике лабораторий работать с такими образцами пока не принято. Провирусная ДНК в качестве объекта генотипирования в коммерческих тестах не применяется, хотя теоретически может быть очень полезной для анализа «потенциала устойчивости» у пациента, так как именно она содержит в себе все «архивированные» варианты вируса. Исключение составляет анализ тропизма ВИЧ (см. ниже), когда провирусная ДНК может служить равноценной заменой РНК при низких показателях вирусной нагрузки.

На втором этапе полученный генетический материал подвергают амплификации для того, чтобы получить достаточное количество матрицы для работы на последующих этапах. Обычно для этого используют хорошо всем знакомую технику ПЦР. Для повышения чувствительности используют протокол, включающий предварительное ультрацентрифугирование плазмы с целью концентрации вирусных частиц, а иногда дополнительный этап гнездового (nested) ПЦР.

Наконец, третий этап посвящен собственно анализу наличия мутаций лекарственной устойчивости в составе генома ВИЧ. Для этого применяют один из двух подходов.

Виды генотипических тестов. Наиболее распространенный подход заключается в секвенировании участка генома, кодирующего ферменты ВИЧ, потенциально устойчивые к действию лекарственных препаратов. Термином «секвенирование» (от англ. sequence - последовательность) обозначают определение последовательности ДНК. Для последующего анализа полученные последовательности вводят в поисковую систему одной из специально разработанных для этого программ, при этом интерпретацию мутаций производят в контексте всей последовательности, что очень важно, поскольку формирование свойств белка-фермента, как помнит читатель, зависит от всей совокупности аминокислот во всех позициях.

Альтернативный подход заключается в анализе не всей последовательности генома, а лишь отдельных его позиций, связанных с лекарственной устойчивостью ВИЧ. К их числу относятся LiPA-тест (Line probe assay; INNO-LiPA HIV-1 RT, INNO-LiPA Protease, Murex Innogenetics) и технология микрочипов (Genechip, HIV PRT 440 assay, Affymetrix).

Принципы обоих методов схожи: на первом этапе фрагменты ДНК - пробники, содержащие известные мутации, с помощью блотинга переносят на нитроцеллюлозные фильтры в виде отдельных полос (LiPA-тест) или в виде пятен вносят в силиконовые ячейки (Genechip). На последующих этапах амплифицируют РНК, выделенную от пациента, при этом в полученный ампликонвводят метку - биотин (LiPA- тест) или флуоресцеин (Genechip). За гибридизацией ампликонов с пробниками следует этап детекции, основанной на ферментативной реакции (LiPA-тест) или флуоресценции, соответственно.

Ни тот, ни другой методы широкого применения не получили, и в настоящее время коммерческие их варианты не производятся. Главная причина этого состоит в том, что оба подхода дают неполную информацию о составе генома ВИЧ и при этом обладают целым

рядом технических несовершенств. Так, количество полос, которые можно нанести на LiPA-тест, ограничено физически; напротив, число пробников, которые можно разместить на чипе, практически ничем не лимитировано. Тем не менее, при разработке чипов возникают трудности другого рода, связанные с высокой вариабельностью генома ВИЧ, в том числе и в участках, прилегающих к позициям, связанным с устойчивостью. Эти вариации (включая подтип-специфические) мешают гибридизации ампликона вплоть до полного отсутствия позитивного сигнала; вследствие этого в ходе испытаний Genechip была выявлена недостаточная эффективность в отношении неВ-подтипов и многочисленные проблемы с интерпретацией. Стоимость LiPA-теста сравнима со стоимостью прямого секвенирования, хотя по мере ее снижения эти сравнительно простые и не требующие дорогостоящего оборудования системы могли бы найти применение в практике лабораторий развивающихся стран, тем более, что у них есть и достоинства - они способны выявлять мутации, содержащиеся в 1-10% популяции вирусов (для сравнения, известные на сегодня тесты выявляют мутантный вирус, составляющий минимум 20-25% популяции).

В практике современных лабораторий, таким образом, генотипирование ВИЧ практически всегда основано на прямом секвенировании. Завершающим этапом процедуры генотипиро- вания становится интерпретация данных о геноме вируса. Для этого последовательность РНК изучаемого вируса переводят в аминокислотную последовательность, затем сравнивают ее с аналогичной последовательностью вируса «дикого типа» и выявляют позиции, связанные с изменением чувствительности к лекарственным препаратам. На основании полученных данных делают выводы о причинах вирусологического/клинического неуспеха и прогнозируют эффективность альтернативных препаратов (см. далее).

Принципы прямого секвенирования генома ВИЧ. В России разрешены к применению три вида коммерческих тестов для генотипирования ВИЧ - Viroseq HIV-1 (Abbott Laboratories), TruGene HIV-1 genotyping assay (Siemens) и АмплиСенс HIV-Resist-Seq (ЦНИИ эпидемиологии). За рубежом также используются некоторые другие тест-системы, например, GeneSeq HIV (ViroLogic) и HIV GenoSure (LabCorp). Во многих странах мира к использованию также разрешены многочисленные in-house тест-системы (разумеется, после того, как они докажут свою надежность в сравнительных испытаниях), однако в России такой способ лабораторного анализа не практикуется.

В основе всех трех тестов, применяемых в лабораториях для генотипирования ВИЧ, лежит принцип так называемого циклического секвенирования (cycle sequencing). Сам принцип, в основе которого лежит остановка синтеза цепи, был разработан еще в 70-х годах прошлого века Фредериком Сэнгером (Fredrick Sanger) и с тех пор успешно применяется в разных модификациях.

Процесс циклического секвенирования сильно напоминает хорошо всем известную полимеразную цепную реакцию (ПЦР): в составе реакционной смеси, кроме матрицы - исследуемой ДНК (продукта реакций

ОТ и ПЦР), тоже находятся дезокси- нуклеотидтрифосфаты (dNTPs), праймеры, фермент ДНК-полимераза и буфер. Принципиальное отличие заключено в том, что, кроме dNTPs, к смеси в небольшом количестве добавлены так называемые дидезокситрифос- фаты нуклеотидов (ddNTPs).

Эти молекулы - производные dNTPs способны присоединяться к последнему нуклеотиду строящейся цепочки, однако потенциальная связь для присоединения следующего нуклеотида у них отсутствует, и после встраивания любого из ddNTPs синтез новой цепи ДНК прекращается (терминируется), поэтому ddNTPs получили название терминаторов. Это событие происходит не часто, потому что в смеси в избытке находятся dNTPs, а терминаторы присутствуют в недостатке, конкурируя с обычными нуклеотидами за встраивание в цепочку (например, в составе тест-системы TruGene это соотношение составляет 300:1). В результате циклической ре-

акции успевают синтезироваться все варианты фрагментов ДНК - от самого короткого до самого длинного, соответствующего всей длине ампликона. Полный комплект фрагментов образует «лесенку» (ladder), которая становится объектом дальнейшего анализа - на этот раз методом электрофореза в полиакриламидном геле, то есть разделения фрагментов в электрическом поле в зависимости от длины. Для того, чтобы зарегистрировать порядок фрагментов после электрофоретического разделения, их нужно пометить, например, флуоресцентной меткой; для этого применяются два подхода.

В первом случае (dye-terminator)

используются меченые ddNTPs (каждый - своей меткой со специфичной длиной волны), при этом все они добавляются в одну пробирку, а электрофорез проводится в одном капилляре. Образующиеся фрагменты оказываются помечены на З'-конце. В составе секвенатора - машины для проведения последней стадии секвенирования прибор для электрофореза соединен с лазерным регистрирующим устройством, которое распознает не только положение (размер) фрагмента, но и связанную с ним метку, соответствующую последнему З'-нуклеотиду в цепочке каждого фрагмента. Этот подход применен в тест-системах Viroseq и АмплиСенс.

Во втором случае (dye-primer) метят праймеры, при этом приходится использовать четыре разные пробирки, в каждой из которых находится лишь один из ddNTPs, а разделение фрагментов проводить в разных ячейках электрофореза. Тест-система Тш- Gene основана на применении именно такого варианта циклического секвенирования, который в составе этого теста именуется CLIP-реакцией (от cross- linking immuno precipitation; происхождение этого сокращения не вполне ясно). Для получения объединенного (комбинированного) результата регистрации применяется специальное программное обеспечение, и данные о генотипе, полученные обоими методами, выглядят практически одинаково. Читать визуальные результаты легко: каждый из четырех цветных пиков кривой соответствует одному из нуклеотидов, а порядок пиков - порядку нуклеотидов в составе ДНК; впрочем, для прочтения таких кривых также применяются специальные программы, и конечным результатом секвенирования, который получает оператор, становится четырехбуквенный текст последовательности ДНК (sequence).

Сравнение тест-систем для генотипирования ВИЧ. Все три тест-системы предназначены для секвенирования одной и той же области генома - гена ро/, кодирующего все ферменты ВИЧ. Известно, что специфические мутации в PR и RT сосредоточены в позициях 10-93 и 41-236, соответственно. Все тесты анализируют эти позиции, однако несколько различаются координатами исследуемых участков.

Тест Viroseq определяет полную последовательность участка, кодирующего протеазу (PR) (с 1 по 99 аминокислоту), а также секвенирует обратную транскриптазу (RT) с самого начала до 335-ой аминокислоты

  • (отсчет начинается индивидуально для каждого белка). Область анализа TruGene включает почти полную последовательность PR (4-99) и ограничивается частью PR, в которой встречаются мутации устойчивости
  • (36-247) . В отличие от первых двух тестов, Амплисенс не только способен анализировать мутации в PR (1-99) и RT (30-265), но также в зависимости от комплектации может включать в себя набор для секвени-

рования области, кодирующей инте- гразу (IN) (91-288), а при необходимости дополнительно анализировать участок гена env, кодирующий петлю V3 др120, с целью определения тропизма ВИЧ (см. далее).

В практике лечения ВИЧ-инфекции все чаще применяются ралтегравир и маравирок, поэтому тест-системы Viroseq и TruGene также готовятся к модернизации, в результате которой усовершенствованные наборы будут включать в свой состав набор реагентов для анализа IN и др120.

Каждая из тест-систем имеет собственное программное обеспечение для анализа, редактирования и интерпретации результатов генотипирова- ния, а также позволяет получать последовательности в форматах, пригодных для последующего дополнительного изучения с применением инструментов on-line (*.txt, *.fasta) и научных исследований. Подробнее об интерпретации результатов генотипирования с применением всех тест-систем речь пойдет в следующей главе.

Надежная работа всех трех тестов обеспечивается при вирусной нагрузке от 1000 копий РНК/мл, хотя значительная часть образцов с содержанием вируса от 300 до 1000 копий РНК/мл также поддается анализу; иногда для этого требуется предварительное концентрирование вирусных частиц из большого объема плазмы, а в ряде случаев к протоколу добавляют еще один раунд ПЦР (nested PCR). Время выполнения анализа составляет от трех до пяти дней.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >