ГЛАВА. Лабораторный анализ резистентности ВИЧ

Способы анализа устойчивости ВИЧ

Говоря об терминологии, хотелось бы сразу сказать, что в условиях практической лаборатории речь идет об анализе именно устойчивости, но не чувствительности ВИЧ. Чувствительность вируса к препарату измеряется концентрацией препарата, которая подавляет его размножение, и других определений этого понятия не существует. Устойчивость, или резистентность вируса - это сниженная чувствительность; на практике так обозначают способность вируса размножаться в присутствии стандартных доз препарата (при этом повышенные концентрации чаще всего все же способны подавить репликацию). Измерить устойчивость трудно, но можно, и об этом пойдет речь далее, однако в рутинных клинических условиях степень устойчивости, как правило, не обсуждается. Говоря о резистентности ВИЧ, чаще всего имеют в виду факт наличия мутационных изменений в геноме, не задаваясь вопросом о том, насколько эти изменения сказываются на свойствах вируса - чувствительности и репликативной способности, между тем как это, конечно, тоже может быть важно. Кроме того, все существующие на данный момент тесты для анализа устойчивости выдают ответ только о том, к каким препаратам вирус недостаточно чувствителен, однако готовых решений по формированию новой, более эффективной схемы лечения ни один из них не предлагает, и после получения результата теста наступает следующий ответственный момент - интерпретация, которой будет посвящена отдельная глава.

Анализ резистентности ВИЧ давно уже зарекомендовал себя в клинической практике в качестве эффективного инструмента, помогающего предотвратить неудачу лечения и восстановить контроль над репликацией вируса после того, как у пациента уже был отмечен вирусологический неуспех. Результаты клинических испытаний также однозначно продемонстрировали, что клинический успех 1) значительно чаще достигается при условии использования данных о генотипе ВИЧ, чем без них, и 2) зависит от числа препаратов в схеме, к которым вирус чувствителен.

Для определения резистентности ВИЧ разработаны и применяются два вида тестов: генотипические и фенотипические. Методы эти принципиально различаются как объектами исследования, так и характером получаемых результатов.

Фенотипические методы используют прямой подход к изучению чувствительности ВИЧ. Как помнит читатель, устойчивый вирус отличается от

«дикого» тем, что для подавления его репликации нужны более высокие (иногда на несколько порядков) концентрации лекарственного препарата. Наиболее традиционный вариант анализа чувствительности ВИЧ, который много лет с успехом был использован (и продолжает использоваться) для оценки эффективности новых препаратов, заключается в том, что «дикий» и исследуемый вирусы культивируют параллельно, добавляя лекарство в разных, обычно градиентно повышающихся концентрациях. Сравнивая эффективность размножения мутантного и «дикого» вирусов, определяют степень устойчивости (кратность резистентности).

Такие исследования непосредственно оценивают способность вируса к размножению в присутствии препарата и дают наиболее приближенный к действительности результат, вот почему они по праву считаются «золотым стандартом» определения резистентности ВИЧ. Тем не менее, в рутинной практике диагностических лабораторий их применить практически невозможно, поскольку в их основе находится культивирование вируса, выделенного из плазмы крови пациента, а это задача не из простых и даже в условиях специализированных научных лабораторий решается далеко не всегда. Кроме того, такие исследования сопряжены с большими расходами, необходимостью специальных условий для работы и требуют очень большого опыта. В современной лаборатории для фенотипической оценки устойчивости используются другие подходы (см. далее), при этом

V ГЛАВА. Лабораторный анализ резистентности ВИЧ

содержание теста остается прежним - это прямое измерение активности репликации ВИЧ под действием лекарственного препарата.

Генотипирование основано на непрямой оценке резистентности путем выявления мутаций генома ВИЧ, ассоциированных с устойчивостью в случаях вирусологического неуспеха лечения. Такие методы используются широко благодаря относительной дешевизне, скорости и простоте выполнения, однако эти достоинства достаются ценой существенно меньшей надежности тестов (см. далее). Для того, чтобы понять, почему это так, попробуем разобраться в принципе, на котором основано применение генотипических тестов.

Хорошо известно, что свойства белка (например, устойчивость фермента ВИЧ к действию какого-либо препарата) определяются в конечном счете той объемной структурой, которую он приобретает в ходе постепенного формирования. Первый этап этого процесса - синтез аминокислотной цепочки (первичная структура белка), которая затем образует вторичную структуру (а-спираль или (3-складки); после этого должна произойти укладка третичной структуры, а иногда, после объединения нескольких молекул белка и присоединения дополнительных небелковых молекул (например, ионов металлов) - и четвертичной.

Для читателя очевиден тот факт, что анализ генотипа, то есть последовательности РНК ВИЧ, позволяет лишь трансформировать ее в последовательность аминокислот, однако информация о формировании более высоких порядков организации белка- фермента остается закрытой. Никакого алгоритма, однозначно связывающего между собой первичную структуру белка и его свойства, до сих пор

не существует, хотя огромное число исследований посвящено именно этому вопросу. Вот почему для анализа генотипа ВИЧ применяют совсем другой подход, проводя сравнение полученной последовательности с уже известными генотипами ВИЧ (последовательностями РНК ВИЧ), хранящимися в специальной базе данных. Каждая из таких последовательностей получена ранее, как правило, от пациентов, испытавших неуспех терапии тем или иным препаратом, и содержит определенный набор мутаций в геноме ВИЧ. Поиск наиболее близкой последовательности в базе данных и составляет сущность интерпретации результатов генотипирования.

Огромное разнообразие вариантов ВИЧ, о котором в этой книжке уже много говорилось, не позволяет даже надеяться найти в базе данных точной такой же генотип, как у обследуемого пациента, поэтому ориентироваться всегда приходится на ближайший похожий вариант. В большинстве случаев этого оказывается достаточно, и у пациентов, имеющих одинаковый набор мутаций, характер устойчивости ВИЧ тоже оказывается одинаковым, однако так бывает не всегда, и именно поэтому часть (15-20%) случаев анализа генотипа дают расхождения с данными фенотипирова- ния (если они доступны) (см. далее). В целом надежность генотипического анализа пока не превышает 80-85%. Такая ситуация, разумеется, будет исправляться, и по мере расширения баз данных надежность генотипирования станет асимптотически приближаться к 100%, однако на сегодняшний день она все еще оставляет желать много лучшего, и причины этого для читателя теперь окончательно прояснились.

Наконец, в практике нашего времени все чаще звучит термин «виртуальный фенотип», который не всегда употребляется по назначению. Этот подход, по сути, представляет собой вариант генотипирования, в котором для интерпретации данных используют специальную базу данных, включающую только парные данные генотип-фенотип. Обо всех этих методах и пойдет дальше речь в этой главе.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >