Другие и перспективные препараты ВААРТ

Разработка новых препаратов для лечения ВИЧ-инфекции - задача перманентная, поскольку эффективность терапии постоянно нуждается в повышении, а вирус, в свою очередь, постоянно приспосабливается к лекарствам путем формирования мутаций лекарственной устойчивости, и в каждом раунде неизбежно появляются пациенты, у которых опций для выбора схемы терапии из числа имеющихся лекарств уже не остается.

Среди препаратов, которые находятся в разработке, всегда есть две группы: 1) препараты «старых» классов с новым механизмом действия и 2) принципиально новые препараты, мишенью которых являются белки, ранее в этой роли не использовавшиеся. Задача создания новых препаратов, как правило, состоит в том, чтобы дополнительно ограничить размножение вируса и при этом избежать перекрестной устойчивости со «старыми» препаратами; очевидно, что новые мишени заведомо исключают возможность кросс-резистентности и потому особенно привлекательны. В этом разделе будут приведены лишь несколько примеров для того, чтобы продемонстрировать степень разнообразия подходов к созданию новых лекарств для лечения ВИЧ-инфекции.

Ингибиторы созревания. Эти препараты пока не применяются на практике; первый из них - бевиримат проходит вторую фазу клинических испытаний. Так же как и в случае ингибиторов присоединения, объектом ингибирования является не фермент вируса, а другие вирусные белки - участники процесса размножения. Мишенью для бевиримата служит белок Pr55gag (Gag-предшественик).

При созревании вирусной частицы (на последних этапах сборки или уже за пределами клетки) происходит ка-

скадное трехступенчатое нарезание Pr55gag с участием протеазы ВИЧ. Его конечным результатом становится образование матриксного белка р17 (МА), капсидного белка р24 (СА) и нескольких коротких полипептидов - нуклеокапсида (р9, NC), позднего белка рб и двух «вставочных» белков (spacer peptides) - SP1 и SP2. На предпоследней ступени формирования СА образуется белок р25, включающий р24 и SP1. Именно белок р24 отвечает за окончательное формирование инфекционных вирусных частиц ВИЧ.

Бевиримат обладает способностью связываться в участке Pr55gag между р24 и SP1, тем самым препятствуя протеолитическому действию протеазы и блокируя созревание р24. Вместо него образуется неспособный к участию в сборке новых вирионов CA-SP1.

Мутации к бевиримату, выявленные в ходе доклинических испытаний, локализованы в С-концевой области р24 (H226V, L231F, L231M) либо в N-концевой части SP1 (A1V, АЗТ, A3V). Их механизм предположительно связан с аллостерическими изменениями в структуре предшественника и блокированием доступа препарата.

«Цинковые пальиы». Этот совсем новый класс препаратов находится в разработке давно, и не только для лечения ВИЧ-инфекции. По сути дела, это первый практический пример подхода к лечению, основанного на генной терапии.

Идея заключается в использовании феномена «цинковых пальцев» (zinc fingers) - так называют участки белков, способные осуществлять связывание ионов цинка. Обычно такие мо

тивы включают около 30 аминокислот, среди которых обязательно присутствуют две пары остатков гистидина и цистеина, собственно ответственные за взаимодействие с катионами Zn++. Некоторые из таких мотивов действительно связывают цинк, другие вместо этого удерживают ионы других металлов или даже неметаллов, формируя структуры, напоминающие «пальцы» (иногда сравнение проводят с кастетом). Некоторые из представителей этой многочисленной и разнообразной группы способны связывать ДНК и принимают активное участие в формировании и стабилизации ее структуры (то есть играют роль шаперонов). После связывания молекула ДНК приобретает жесткость и уже не подвержена изменениям конформации.

Для создания генно-терапевтического препарата мотивы «цинковых пальцев» объединяют с ферментом - нуклеазой (в этой роли чаще всего используют бактериальную ре- стриктазу Fokl) ; в составе такой генно-инженерной конструкции под труднопереводимым названием zinc finger nucleases обычно находятся от трех до шести «пальцев» и нуклеаз- ный домен. «Пальцевой» домен распознает последовательность ДНК с высокой специфичностью (от 9 до 18 нуклеотидов), а нуклеаза расщепляет молекулу, делая невозможной ее дальнейшую полноценную экспрессию.

Препараты с таким механизмом действия уже разрабатываются для лечения ВИЧ-инфекции; их мишенью является ген CCR5, а результатом становится изменение фенотипа клеток, аналогичное природной

делеции Д32. «Выключение» этого гена препятствует формированию корецепторов и тем самым предотвращает проникновение ВИЧ в чувствительные клетки. Другой вариант использования того же подхода - использование в качестве мишени не хромосомного гена, а непосредственно провирусной ДНК; эта стратегия находится в самом начале разработки и преследует еще более претенциозную цель - функциональное излечение (functional cure) ВИЧ- инфекции в результате «вырезания»

провируса из латентно инфицированных клеток.

Другой механизм, связанный с существованием «цинковых пальцев», основан на их непосредственном ингибировании. Его результатом становится высвобождение ионов Zn («выталкивание»; препараты получили название zinc ejectors), разрушение конформации и утрата функциональности «пальцев». Учитывая важную роль конформации ДНК на основных этапах жизненного цикла ВИЧ - обратной и прямой транскрипции, а также интеграции, легко понять, что последствия применения этих ингибиторов для вируса могут быть самыми драматическими. Эта группа препаратов уже проходит клинические испытания.

Ингибиторы LEDGF/P75. Белок клеток человека LEDGF (lens epithelium- derived growth factor) принято считать одним из факторов транскрипции; одна из изоформ LEDGF носит название р75, и именно она, как выяснилось, способна взаимодействовать синтегразой ВИЧ. Роль этого хозяйского белка для размножения ВИЧ очень велика, ведь в культуре клеток, лишенных полноценного белка LEDGF/ р75, вирус почти не размножается. Как теперь стало понятно, LEDGF/ р75 является главным организатором встраивания провирусной ДНК и стабилизации ее в хромосоме хозяйской клетки. Это особенно важно для ВИЧ, который, как известно, способен заражать неделящиеся клетки.

В клетках, которые находятся вне состояния митоза, большая часть ДНК, как принято говорить, транскрип- ционно неактивна и находится в составе хроматина. Это означает, что она практически полностью «укутана» белками-гистонами и недоступна не только для факторов транскрипции, но и для «посадки» и внедрения провируса. Есть только незначительное число участков ДНК, которые заняты в транскрипции и потому освобождены от гистонов и прочих белков, организующих структуру хроматина. Поиском таких участков для ВИЧ и занимается LEDGF/p75.

Этот белок ядерной локализации встречается повсеместно, и хотя его регулярная функция до конца не выяснена, точно можно сказать, что он так или иначе вовлечен в процесс регулирования транскрипции. Он прочно ассоциирован с хроматином и в «обычной жизни», то есть в отсутствие ВИЧ, выступает в роли одного из кофакторов транскрипции, которых, как известно, существует великое множество. В клетке, зараженной ВИЧ, LEDGF/p75 выступает в роли «гостеприимного хозяина» и, «подхватив» преинтеграционный комплекс (PIC) сразу же после пересечения ядерной мембраны, сопровождает его к месту интеграции. У вируса нет «постоянной прописки» в составе генома хозяина, однако предпочтительные участки, характеризующиеся определенной структурой и чаще других оказывающиеся в активном состоянии, имеют-

ся, и именно в их «опознании» участвует LEDGF/p75. Такие свободные участки ДНК становятся мишенью для интеграции; кроме того, LEDGF/ р75 способствует удержанию (tethering) и стабилизации провирусной ДНК в нужной локализации до тех пор, пока она не закрепится в составе хромосомной ДНК.

Взаимодействие LEDGF/p75 с ин- тегразой происходит за счет С-концевого участка фермента, и именно этот контакт стал мишенью разработок нового класса препаратов - ингибиторов LEDGF/p75 (LED- GINs). В качестве молекул, способных разобщить это взаимодействие, уже апробировано множество разных химических соединений; некоторые из них оказались довольно успешными и сейчас продолжают участвовать в протоколах испытаний. Результатом разобщения на практике становится отмена интеграции провируса в хромосому, которая в принципе способна полностью отменить размножение ВИЧ, вот почему на этот класс препаратов возлагаются большие надежды.

Ингибиторы деацетилаз. Объек- том воздействия этой группы препаратов тоже является хроматин, но замысел состоит совсем в другом. Задача их применения направлена не на ограничение размножения вируса, а, наоборот, на активизацию этого процесса в латентно инфицированных клетках.

О состоянии латентности читатель уже слышал многое; так называют отсутствие продукции вируса при условии минимальной экспрессии генома ВИЧ в инфицированных клетках. Уровень этой экспрессии определяется не местом внедрения провируса, а его окружением, то есть наличием вирусных и клеточных факторов транскрипции. В латентно

инфицированной клетке хромосомная ДНК, а вместе с ней и провирус «упакованы» в составе хроматина, будучи тесно связаны с белками-гистонами. Такая плотная «упаковка» не подпускает транскрипционные факторы ни к генам хромосомы, ни к провирусу; таким образом, транскрипции генома ВИЧ не происходит, а значит, продукция вируса отменяется.

Состояние гистонов, в свою очередь, зависит от их модификации (post-transcriptional modifications) - фосфорилирования, ацетилирования, метилирования, гликозилирования и т.д. Эти модификации серьезным образом сказываются на структуре и функции гистонов, а также на характере их связи с ДНК. Например, ацети- лированные гистоны «расслабляют» эту связь и позволяют факторам транскрипции приблизиться к ДНК и выполнить свою задачу. Напротив, деацетилирование гистонов с участием ферментов - гистоновых деа- цетилаз (histone deacetylases, HDACs) приводит к «уплотнению» хроматина и подавлению транскрипции.

На этом и основано действие препаратов, которые объединяются в группу ингибиторов HDACs; впервые они были апробированы для лечения онкологических заболеваний, а потом, как это часто случалось, нашли применение в лечении ВИЧ-инфекции. Первый препарат из этой группы получил название во- риностат (vorinostat) и уже проходит испытания. Смысл его действия заключается в следующем: переведя гистоны в ацетилированное состояние, «расчистить» участок ДНК, привлечь транскрипционные факторы, вызвать транскрипцию провирусного генома и заставить латентно инфицированные клетки производить вирусные частицы. Расчет здесь строится на том, что параллельно с вори- ностатом применяются и препараты обычной схемы терапии, включающей воздействие на ферменты ВИЧ. Ферменты, как известно, становятся

объектом действия лекарств только в клетках, производящих вирусы. Таким образом, вориностат «превращает» клетки, бывшие ранее неуязвимыми для лечения, в мишени для терапии. По замыслу исследователей, по мере применения такой схемы лечения постепенно все латентные клетки будут выведены из этого состояния и уничтожены. В условиях in vitro эта гипотеза подтверждается, однако собственно клинических испытаний пока не проводилось, и их результатов с нетерпением ждут врачи и пациенты.

Итак, принципиально новых идей много, и все они по-своему интересны и многообещающи; тем не менее, с сожалением приходится вернуть читателя к реальности и вновь заняться рассмотрением вопросов, непосредственно имеющих отношение к текущей практике и стандартным ситуациям, возникающим при формировании лекарственно устойчивых штаммов ВИЧ.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >