ГЛАВА. Частные вопросы лекарственной устойчивости ВИЧ

Успешная терапия ВИЧ-инфекции всегда основана на применении комбинации препаратов, как правило, из разных классов. Мутации к каждому из классов препаратов формируются независимо друг от друга, затрагивают разные участки генома ВИЧ и не проявляют «межклассовой» перекрестной резистентности.

В данной главе будут очень кратко рассмотрены механизмы действия всех классов препаратов, имеющихся в арсенале терапии - ингибиторы ферментов RT, PR и IN, ингибиторы слияния и антагонисты корецепторов, а также охарактеризованы способы формирования устойчивости вируса, ассоциированные с каждой из этих групп лекарственных средств.

Ферменты ВИЧ, механизмы действия и устойчивости к ингибиторам

Все три фермента ВИЧ - протеаза (protease, PR), интеграза (integrase, IN) и обратная транскриптаза (reverse transcriptase, RT) - продукты гена pol и в ходе трансляции считываются в виде общего белка-предшественника

Gag-Po/(p160). Такой предшественник образуется наряду с предшественником р55 благодаря существованию феномена «игнорирования» стоп- кодона и сдвига рамки считывания на уровне трансляции.

Заключается он в следующем: gag и pol- это разные гены с несовпадающими рамками считывания, которые перекрываются на 205-214 нуклеотидов. На З’-конце gag есть специальный сигнал, который позволяет рибосоме в ходе трансляции «проскочить» опасный участок на границе генов gag и pol «без остановки». Этот сигнальный участок включает два основных элемента: первый из них-это «скользкий» участок UUUUUUA, второй имеет форму петли (stem-loop)n, как предполагают, «притормаживает» РНК- полимеразу таким образом, что она «соскальзывает» на один нуклеотид назад (в направлении 5’) и затем продолжает считывание уже со сдвигом «минус 1». Такую «оплошность» рибосома допускает в 5% случаев, поэтому Gag- и Gag-Pol- предшественники продуцируются в отношении 20:1.

В ходе протеолиза Gag-Pol- предшественника при созревании вирусных частиц полипептид Pol «отрезается» от Gag и образует белки PR (р10), RT (р66+р51) и IN(p31).

Обратная транскриптаза (RT). Гетеродимер, состоящий из двух разных субъединиц - р65 (560 аминокислот) и р50 (440 аминокислот). Этот фермент последовательно катализирует три реакции: 1) реакцию обратной транскрипции (выполняя функцию РНК-зависимой ДНК-полимеразы), 2) разрушение РНК в составе получившейся гибридной РНК-кДНК молекулы (в роли РНКзы) и 3) достройка второй цепи с образованием двуцепочечной ДНК (ДНК-полимеразная активность). Функции фермента разделены между двумя его субъединицами: полимеразные активности принадлежат субъединице р51,

РНКаза-Н-активность сосредоточена в большей субъединице.

В реакции собственно обратной транскрипции в качестве матрицы используется вирусная РНК, которая оказалась в цитоплазме клетки после присоединения к ней вирусной частицы и ее «раздевания». Строительный материал - природные нуклеотиды (A, G, Т и С), как правило, находятся в окружении РНК в достаточном количестве. События развиваются в активном центре RT, где происходит поочередное присоединение нуклеотидов по принципу комплементарности с образованием комплементарной ДНК (кДНК).

Присоединению нуклеотида предшествует троекратное фосфорилирование его предшественника - ну- клеозида с образованием трифос- фатной группы, которая и оказывается тем «крючком», к которому «прикрепляется» следующий в цепочке нуклеотид. Ни сами нуклеозиды, ни промежуточные продукты фосфорилирования - моно- и дифосфаты нуклеозидов встроиться в растущую цепочку не могут. Этот этап наиболее уязвим в отношении возможности возникновения мутаций, поскольку ошибочное встраивание нуклеотидов происходит достаточно часто.

После образования гибридной молекулы РНК-кДНК РНК-матрица быстро разрушается, при этом все мутации, которые могли произойти в ходе реакции обратной транскрипции, сохраняются в составе «ДНК - ведь RT, в отличие, например, от ДНК- полимеразы, не имеет самокорректирующего механизма. Вот почему му-

тации, сформировавшиеся на этапе обратной транскрипции, немедленно закрепляются в потомстве вируса.

Завершением процесса становится синтез второй цепи ДНК с образованием двуцепочечной молекулы, готовой к интеграции в клеточную ДНК.

НИОТ. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскрипции (НИОТ), первый из которых - азидотимидин был впервые применен еще в 1980-е годы, открыли собой эпоху антиретровирусной терапии. Эти препараты (ставу- дин, ламивудин) представляют собой аналоги естественных нуклеозидов (или моно- и дифосфатов нуклеозидов, или нуклеотидов), химическая структура которых изменена таким образом, что способность к формированию связи со следующим «кирпичиком» в цепи кДНК утрачена. Концентрация таких измененных «кирпичиков» в клетке достаточно высока для того, чтобы, вступая в конкуренцию с природными нуклеотидами, они имели преимущество при встраивании в новые цепочки «ДНК. После образования связи между молекулой НИОТ и предыдущим нуклеотидом синтез кДНК прекращается.

Итак, механизм ингибирования реакции обратной транскрипции при участии НИОТ заключается в остановке синтеза кДНК после встраивания очередной молекулы измененного нуклеозида (терминация цепи). Выключение первого этапа размножения ВИЧ в клетке закономерно приводит к прекращению образования новых вирусных частиц.

Формируя резистентность к НИОТ, вирус выбирает один из двух путей: блокирование присоединения новых молекул НИОТ или вырезание из цепи кДНК уже встроившихся нуклеотидов.

Первый механизм устойчивости к НИОТ связан с возникновением мутаций, затрагивающих активный

центр фермента (полимеразную субъединицу) и создающих стериче- ские помехи для вхождения в него молекул лекарства - фосфорилирован- ных аналогов нуклеозидов (примерами могут служить M184V и Q151M). Иногда этот механизм называют дискриминационным, имея в виду, что мутантный фермент делает выбор в пользу природных нуклеотидов, ограничивая включение нуклеотидных аналогов. Природные молекулы нуклеотидов продолжают беспрепятственно встраиваться в растущую цепочку кДНК, и вирус продолжает размножаться.

Мутации, лежащие в основе второго механизма устойчивости к НИОТ, усиливают способность RT к так называемой реакции пирофосфороли- за. В ходе реакций матричного синтеза, включая обратную транскрипцию, встраивание нового нуклеотида (в форме трифосфата) сопровождается высвобождением дифосфата, при этом оставшийся третий фосфат образует новую связь. Пирофосфоро- лиз - обратный процесс, при котором восстанавливается трифосфатная группа, при этом нуклеотид покидает цепочку; это явление получило название эксцизии («вырезания»).

Таким образом, благодаря существованию второго механизма устойчивости ВИЧ становится способен «разблокировать» синтез кДНК, прежде остановленный в результате

встраивания молекулы НИОТ. Такие мутации получили название тимидин- аналоговых (thymidine analog mutations,TAMs), поскольку формируются они под действием аналогов тимидина (азидотимидина и d4T). Более подробно они будут рассмотрены в конце этого раздела.

ННИОТ. Химическая природа этих ингибиторов (невирапин, делавирдин, эфавиренц) очень разнообразна, и, как видно из названия класса, они ничем не похожи на нуклеозидные аналоги. Механизм их ингибирующего воздействия на ВИЧ также совсем иной.

Никаких метаболических внутриклеточных превращений (таких, как фосфорилирование) для ННИОТ не требуется. Оказавшись в цитоплазме, они направляются в сторону гидрофобного «кармана» RT, расположенного в непосредственной близости от активного центра фермента. Будучи прочно связаны в этой позиции, они изменяют объемную структуру (конформацию) активного центра RT,

ограничивая подвижность его отдельных участков друг относительно друга, и тем самым препятствуют реакции полимеризации кДНК (возможно, при этом также затрудняется вход в активный центр ионов металлов, необходимых для осуществления функции фермента). Иногда изменения, происходящие в это время с активным центром RT, сравнивают с «сжиманием кулачка», при котором подвижность отдельных «пальцев» становится невозможной.

Самые известные мутации устойчивости к ННИОТ - L100I, K103N, V106A, V108I, Y181C/I, Y188C/L, G190A/E/S, Р225Н и P236L67. Механизм их действия совсем прост -появление таких мутаций видоизменяет трехмерную структуру фермента таким образом, что присоединение молекулы ингибитора становится затруднительным, при

этом собственно ферментативные

свойства RT (и относительная подвижность активного центра) существенно не страдают. Мишенью для большинства ННИОТ является один и тот же участок фермента (за исключением этравирина), поэтому для этого класса ингибиторов так характерна перекрестная устойчивость - мутация в этом участке препятствует связыванию сразу нескольких препаратов.

ННИОТ второго поколения (этра- вирин, рилпиврин) отличаются от своих предшественников особенной гибкостью молекулы, что позволяет им связывать активный центр фермента, уже имеющий мутации устойчивости. Это означает, что новые препараты можно успешно применять примерно у 80% пациентов с кросс-резистентностью к ННИОТ. Мутации устойчивости к ETV тоже существуют, но их набор отличается от описанного выше (V90I, A98G, L100I, К101Е/Р, V106I, V179D/F).

Протеаза (PR). Этот фермент имеет димерную структуру, при этом его субъединицы идентичны и образуют единый активный центр на общем интерфейсе. Важная роль в проявлении каталитической способности PR отводится так называемым «клапанам» (claps), прикрывающим собой активный центр. Функция протеазы состоит в посттрансляционном нарезании общего предшественника Gag- Pol с образованием всех ферментов и внутренних белков ВИЧ. Активность этого белка проявляется на последних стадиях формирования вирусных частиц, обеспечивая их созревание. Подавление этой активности законо-

мерно приводит к формированию незрелых частиц, неспособных заражать чувствительные клетки.

Изобретение ингибиторов PR (ИП) происходило на основе достаточно хорошо развитых представлений о структуре фермента, с применением новейших компьютерных технологий создания лекарств. Результатом явилась разработка препаратов, соответствующих по форме активному центру PR и имеющих к нему очень высокое сродство (индинавир, сакви- навир). Тесное взаимодействие с молекулой ингибитора изменяет конформацию активного центра и «клапанов» таким образом, что его способность к нарезанию субстрата практически полностью блокируется. В результате образуются вирусные частицы, в составе которых вместо зрелых белков находятся предшественники; такие частицы неспособны к заражению новых клеток, и размножение вируса таким образом ограничивается.

Мутации устойчивости к ИП могут возникать как непосредственно в активном центре, так и за его пределами. В первом случае связывание молекулы ингибитора становится невозможным из-за конформационных пертурбаций фермента (примерами могут быть мутации D30N, V32I, G48V, I50V,V82A/F/T/S, I84V и L90M, вызывающие устойчивость почти ко всем ингибиторам PR); такие мутации принято называть первичными. Именно для этого класса ингибиторов характерным является снижение фитнеса (жизнеспособности) у вирусов, имеющих первичные мутации устойчивости (см. Ill главу).

Причиной этого явления считается увеличение размеров полости

в составе активного центра, которая связывает как субстрат (белок- предшественник), так и лекарство. Неполный контакт с обоими видами молекул препятствует нарезанию субстрата, с одной стороны, и затрудняет ингибирование этого процесса,

с другой стороны. Это означает, что, хотя мутантная протеаза сохраняет способность нарезать белки- предшественники, делает она это существенно медленнее, и, соответственно, новые вирусные частицы образуются в меньшем количестве.

Мутации в составе «клапанов» (M46I/L, 47, F53L и I54V/L) вносят некоторый вклад в снижение эффективности связывания ингибиторов, но заметной устойчивости в отсутствие других мутаций не вызывают.

Компенсаторные (приспособительные, или вторичные) мутации возникают в разных участках генома ВИЧ (не только в гене pol) и призваны в большей или меньшей степени восстановить утраченную жизнеспособность вирусов, имеющих первичные мутации (A431V, L449F, P453L). Эти мутации у ингибиторов PR сами по себе не вызывают устойчивости и не изменяют ее у резистентных вирусов, хотя некоторые специалисты считают, что вторичные мутации также способны увеличивать объем полости фермента.

Каждая из мутаций снижает чувствительность вируса к ИП не слишком сильно, скорее, высокий уровень устойчивости достигается путем их накопления; это явление характерно для ИП наряду со снижением фитнеса резистентных штаммов и перекрестной резистентностью. Феномен полиморфизма генома ВИЧ, также наиболее ярко проявляющийся в отношении этого класса препаратов, и его роль в терапии и анализе резистентности ВИЧ будут подробнее рассмотрены в VI главе.

Частный интересный случай компенсаторных мутаций устойчивости к ИП-мутации, которые возникают в белке-предшественнике Gag. Они появляются в составе генома вирусов, имеющих мутации в протеазе (например, мутация P453L в Gag у вируса, имеющего в протеазе мутацию устойчивости к APV), при этом повышают не фитнес вируса, а его устойчивость (то есть Ю50). Мутации Gag, ассоциированные с устойчивостью (A431V, L449F, P453L), сосредоточены

исключительно в участках нарезания

предшественника (главным образом в участке SP2, мутации обозначены SP1m, SP2m, и этим отличаются от мутаций, компенсирующих фитнес, которые разбросаны по всему гену.

Механизм действия подобных мутаций еще нуждается в прояснении, но уже сейчас понятно, что на размере ферментативной полости протеазы они никак сказаться не могут, зато изменяют структуру ее природного субстрата таким образом, что мутантной «малодееспособной» протеазе становится гораздо легче выполнить свою функцию. Есть данные, которые указывают на то, что при этом не «исправляется» природный контакт между протеазой и субстратом, а создается новый, альтернативный контакт, компенсирующий «разрыв» между Gag-Pol и мутантной протеазой.

Интеграза (IN). Этот фермент отвечает за самый сложный этап размножения ВИЧ - интеграцию двуцепочечной молекулы ДНК, образовавшейся по завершении обратной транскрипции, в хромосому клетки-хозяина (она может иметь кольцевую либо линейную форму; наиболее эффективно перемещается в ядро клетки и интегрирует в хромосому линейная молекула ДНК, на рисунке - кольцевая форма).

Молекулы IN состоят из двух симметричных субъединиц, каждая из которых включает по три функционально различающихся домена. N-концевой домен и С-концевой участок IN определяют характер и стабильность взаимодействия с ДНК, центральный - каталитический домен несет на себе груз ответственности за все ферментативные реакции, в которых участвует интеграза. Обе каталитические активности IN (см. ниже) требуют обязательного присутствия кофакторов - катионов Мд++ и Мп++, причем

в условиях in vivo преимущественно используется Мд++.

Механизм интеграции охватывает несколько этапов. На первом из них формируется преинтеграционный комплекс (PIC), включающий ДНК и целый арсенал белков, среди которых есть как вирусные (матриксный белок (МА), Vpr, RT)jaK и многочисленные клеточные белки; центральную позицию занимает IN.

На следующем этапе происходит транслокация PIC в ядро. Движение по направлению к ядру определяется наличием у IN так называемых сигналов ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS). Этому процессу мешает ядерная мембрана, размеры пор которой недостаточны для свободного вхождения PIC, поэтому эффективность транслокации зависит от присутствия некоторых клеточных факторов, а также АТФ.

З’-процессинг кДНК происходит в цитоплазме одновременно с предыдущим этапом или даже предшествует ему. На этом этапе интеграза проявляет свою первую ферментативную активность, осуществляя удаление двух нуклеотидов на каждом из 3’- концов вирусной ДНК с образованием свободных гидроксильных (ОН-) групп. Именно эти группы в последующем будут служить точками лигирования молекул вирусной и хромосомной ДНК.

Поиск участка интеграции З'-про- цессированной ДНК также происходит при энергичном участии многочисленных «помощников» из числа клеточных белков. Встраивание может произойти в любую из хромосом, однако участок должен быть транскрипцион- но активен для того, чтобы хромосомная ДНК была «расплетена» в месте внедрения З’-концов вирусной ДНК.

Свою вторую - внутриядерную

активность интегразе удается проявить на этапе переноса цепи, для чего в хромосомной ДНК создаются одноцепочечные 5’-концы. Лигирование их с З’-ОН-концами вирусной ДНК приводит к восстановлению одной из цепочек ДНК, при этом во второй цепи обнаруживается пробел из 4-6 нуклеотидов между провирусной и хромосомной ДНК (на рисунке не показано).

Заключительный этап интеграции - «достраивание» цепи ДНК приводит к формированию провирусной ДНК, которая в дальнейшем будет вести себя так же, как и клеточная ДНК, то есть служить матрицей для транскрипции.

Каждый из этапов интеграции в принципе может быть мишенью для ингибирования, однако пока для лечения ВИЧ-инфекции разработаны препараты только одной группы - ингибиторы переноса цепи (IN strand transfer inhibitors, INSTI). Главным представителем этой группы является ралтегравир (RAL).

Ключевым моментом действия RAL является не изменение конфигурации и непосредственное блокирование активного центра, а связывание с концевыми участками молекулы ДНК, которые образуются в результате З'-процессинга, при этом важная роль принадлежит молекулам Мд++. Связывая ионы металлов (этот феномен носит название хелатирования), ингибитор разобщает взаимодействие ДНК с Мд++ и функционально важными участками IN («гибкой петлей»; на рисунке они обозначены звездочками). Достигаемая таким образом дестабилизация нуклеопротеинового комплекса в последующем приводит к нарушению интеграции вирусной

ДНК и ингибированию репликации вируса в целом.

Механизмы устойчивости к RAL

также отличаются оригинальностью. Вирусологический неуспех в большинстве случаев связан с выявлением одного из трех устойчивых сочетаний мутаций (профилей резистентности). Эти профили формируются независимо друг от друга в результате реализации принципиально различающихся генетических путей.

Каждый их этих путей начинается с одной - первичной мутации: Q148K/ R/H, N155H или Y143C/H/R, однако штаммы, имеющие только первичные мутации, можно встретить лишь в начале периода неуспешного лечения; как правило, уже через несколько недель после старта терапии к ним добавляются дополнительные мутации. Принципиальным отличием вторичных мутаций к RAL является то, что они существенно повышают не только фитнес, но и устойчивость вируса. Каждая из первичных мутаций комбинируется со своим набором вторичных мутаций.

Относительно собственно механизма устойчивости к INSTI пока известно немногое, однако очевидно, что мута-

ции резистентности ассоциированы с какими-то дефектами каталитического центра, приводящими к изменениям распознавания ДНК и связывания ионов металлов.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >